防感煎剂抑制H1N1型流感病毒作用的体外实验研究.pdfVIP

防感煎剂抑制H1N1型流感病毒作用的体外实验研究 陈芳n1刘培¨1陈酷n1宋康D’茅海燕张严峻n1 (1浙江中医药大学第一临床医学院，310006 2浙江省疾病预防控制中心病毒所，310051) 【摘要】 目的研究防感煎剂对H1N1流感病毒的体外抑制作用。方法MDCK 细胞培养后接种H1N1流感病毒液100TCID50，再给予防感煎剂40 mg／ml、20 mg／ml、10mg／ml三个浓度观察细胞病变效应。防感煎剂不同浓度药物与病毒等 量混合作用1．2h后，再加至MDCK细胞，加入MTT观察酶标仪490n．1ll测吸光 度值，计算病毒抑制率。结果三种不同浓度的防感煎剂对H1N1侵染MDCK细 胞都有一定的增殖抑制作用和直接灭杀作用。结论防感煎剂对H1N1流感病毒侵 染MDCK细胞具有一定的病毒抑制作用。 【关键词】H1N1流感病毒；防感煎剂；体外研究 防感煎剂系国家级名老中医宋康教授的经验方，于1998年由浙江省中医院 中药制剂室制成，经十余年临床应用，显示该药有较好的防治流感效果，本实验 主要研究防感煎剂对H1N1型流感病毒的体外治疗作用。 1材料和方法 1．1实验材料 1．1．1药物：防感煎剂，浙江中医药大学第一临床医学院制剂中心制备，药物 品系及质量均合格，按常规方法煎煮2次，合并煎煮液过滤，所得滤液浓缩为生 药5．2 g／ml，药液保存在4C冰箱，临用前用烧杯水浴至室温。阳性对照药达菲胶 囊，75毫克／粒，批号E1184，罗氏大药厂香港有限公司。细胞株：狗肾细胞系 MDCK。 H1N1438 1．1．2病毒株：H1N1流感病毒株(WZ09／12／15)，由浙江省疾病控 制预防中心病毒所提供，在9日龄鸡胚中增殖复壮，收集尿囊液，．70C超低温冰 箱冻存备用。 M)12．5ml 1．1．3主要试剂：MEM培养液：每500ml加入HEPES缓冲液(1 ml(1 U／ml。 (终浓度20—25mm01)，谷氨酰胺12．5 g)，青霉素、链霉素各100 胎牛血清，胰酶等。 1．2实验方法 基金项目：浙江省科技厅重大专项(2009C0301 1．1)资助 1．2．1防感煎剂对流感病毒吸附细胞的影响用96孔细胞培养板将MDCK细 胞培养至长满单层。弃细胞培养液，PBS洗板两次，每孔接种100TCID50流感病 毒液50 h感染细胞。弃病毒液，用PBS洗 pl，于330C、5％C02培养箱中吸附2 板2次，取不同浓度防感煎剂加入已经感染的细胞板中。防感煎剂选用对细胞的 最大无毒浓度(10％抑制率)，2倍连续稀释8．10个浓度，每个浓度10复孔，200pl／ 孔。设置病毒对照组为加病毒、不加防感煎剂实验组，防感煎剂空白对照组为加 防感煎剂、不加病毒实验组，阳性对照组为加病毒和达菲实验组，空白对照组为 不加病毒和防感煎剂实验组。330C、5％C02恒温培养箱中培养，每日倒置显微镜 下观察细胞病变效应(CPE)进展情况，连续7天。第7天，每孔加入四噻唑蓝 (MTT)5 m咖l浓度20“1，370C、5％C02孵育4h，弃去上清液，每孔加入 150 DMSO 值)，空白孔调零，计算病毒抑制率。病毒抑制率％=(各实验组平均OD值一病 毒对照孔平均OD值)／(正常细胞对照孔平均OD值一病毒对照孔平均OD值) x100％ 1．2．2防感煎剂对流感病毒的直接杀灭作用用96孔细胞培养板将MDCK细 胞培养至长满单层。MEM稀释药物，浓度选用对细胞的最大无毒浓度(10％抑制 率)，2倍连续稀释8．10个浓度。弃细胞培养液，PBS洗板两次。将正