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第九屠全事蠢行■学·第八届全军防生物危害医学专蝉木会议论文集 不同来源Seoul病毒S片段末端序列特征 左曙青张淬河江佳謇吴晓明王日民孙培薄王炳才汤芳薮哲蔡伟橱红■务春 军事医学科学院t生物流行瘸研究所，瘸曩t生钕生栩安全国家重点实验室戈京100071 一种单股负链的RNA病毒，其基因组可分为L、M、S三个片段，分别编码病毒的多聚酶、 坦病毒在其动物宿主可长期携带和持续感染而无明显症状，在人类却可引起比较严重的损伤． 有学者研究认为一些RNA病毒在感染过程中，RNA末端丢失或者获得核替酸(DIRNAs)，进 而影响病毒的表达和复制可能是其建立和维持持续感染的机制之一Ⅳl。在一些实验室建立的 哺乳动物细胞持续感染模型中，RNA末端序列丢失现象也获得证实p’oJ。然而，目前对于末端 序列的研究普遍缺乏现场实验数据，因此，它在宿主动物及病例体内的真实状况并不清楚。 本研究对来自同一地区宿主动物和病例标本的Seoul病毒S片段3’末端进行了测定和分析，现 将结果报告如下。 材料与方法 1．标本：病例标本来自北京1H某医院采集的肾综合征出血热患者急性期血标本，根据调 套表确定病例可能暴露地点，夹夜法捕鼠，采集宿主动物，现场解剖，取肺组织带回实验室，’ 经RT-PCR检测阳性作为宿丰动物待测标本。． 室以无菌操作剪取约3mm3大小的鼠肺组织或病人血块，放入灭茼研磨器中，加入Tdzol，充 min， 分研磨后移入Eppcndorf管中；加入氯仿，涡式振荡器上剧烈振荡，4℃，120009离心15 将上清移入新管中；加入异丙醇，4C，t20009离心10min，吸弃上清，加入75％酒精，120009 离心5min，吸弃上清，室温空气干燥RNA。 3．RNA连接和逆转录：应用RNAT4连接酶(TakaRa公司)使RNA自身环化连接。应 (TakaRa公司)。 Premier 为参照序列，应用Palmer 5．0软件设计(表1)，引物由英骏生物工程公司合成。第。‘ DNA聚合酶。 为引物，应朋Taq 表l S片段未端序列扩增所用弓I物 备注： R：AG 5．克隆与测序：产物回收应用三博牛物工程公司的切胶纯化试剂盒。操作按说明书进行。 性克隆送英骏牛物工程公司测序。 第九心令一：流行病学·第八届伞1：防尘物危害医学专_k学术会议论文集 件进行列阵比较。荠异序列运用RNAstructure3．5软件，进行二级结构预测。 结果 扩‘增，包括3份人曲．标本、两份褐家鼠标本，均可得剑口的片段大小的附陛带。 2．克隆测序及列阵分析：将目的片段切胶纯化，迕接、转化T载体后，每个标本随机挑 取4．7个克隆，共22个克隆，送英骏生物T科公司，廊川ABI3700自动洲序仪121JJ Jt-。将测 序的4个II 相比3’端缺火22bp。将全部日的序列列阵比较，可清楚地显示其荠异位点(图1)。 川RNAstructure3．5软件进行二级结构预测，结果她图2。I…刭【hIJ‘见，jj以往研究棚似，Seoul GenBank li-i注册的绝大多数细胞分离株s”段未端序列预洲结果，其3‘米端彳r3个碱』，I形成 I’f，j小尾巴，木研究lIt所扶得的l8个阳性克隆，It尢一‘例仃类似结构。图2Bj-矗尔术研究·1-所状 得的绝大多数卧陛克隆S片段米端J-]：歹l-l：Iifll0结果，儿3’术端‘j5’未端H补们丸小尼IZ。罔2C lit‘未端序列预测 渺示木研究巾扶程“内来I-I卜J一剃家鼠标木的曲个克隆S片段3’术端缺火14bp 结果，jI3’末端j√5’末端一I』．补结构消，人，代之以5’未端反折，ll匕外，【II5’端形成的人|，|《J突起 fl,J未端 也消火。l刳2D皿7示本研