液态深层培养黑管菌高产漆酶的工业化前期技术研究.pdfVIP

液态深层培养黑管菌高产漆酶的工业化前期技术研究 王剑锋l，2，王璋1母 1(中国食品发酵工业研究院，北京，100027) 2(西北大学生命科学学院，西安，710069) 漆酶(1accase，苯二醇：氧氧化还原酶，EC1．10．3．2)，是一类含铜多酚氧化还 原酶，已有诸多研究结果表明，漆酶的底物广泛多样，参与木质素的降解过程， 能有效降解木质素本身以及与木质素结构单元类似的包括DDT、二嗯英、多氯联 苯、苯并芘、杂酚油等一系列环境污染性物质，因而，真菌漆酶在生物制浆、生 物漂白、环境修复、绿色有机合成、生物传感器、食品加工诸领域有着巨大的应 用价值。 本研究首先对各种相关微生物在液态培养下生物合成漆酶可能性的产 酶规律进行初步分析比较，并根据酶催化反应及其结果的特征性质，设计了一 个利用经济性酶作用底物的简易、有效快速测定试验方法来作为初筛手段，从野 外杨树堆中分离到一株漆酶高效产生菌WZFF．W-Y11，经过初步驯化培养后，摇 瓶培养7d酶活可达318 IU／ml(以愈创木酚为底物)。根据其生长特性、以及子实 体、孢子、菌丝等等形态特征性质，按照《中国真菌志第三卷．多孔菌科》，确定该 adusta，也 菌为担子菌纲、非褶菌目、多孔菌科、黑管菌属的黑管菌(Bjerkandera 称烟管菌)。 以黑管菌生产真菌漆酶在国内未见报道，国外也十分少见。为了进一步提高 黑管菌WZFF．W-Y11菌株的漆酶生产能力，实验首先采用单因素分析和正交析因 试验方法等研究黑管菌漆酶的酶系分布、产生规律以及营养条件和生产工艺技术。 实验结果表明，该黑管菌漆酶几乎为胞外酶，而且存在着至少两种同工酶，分子 量约为68KDa的酶分子占90％以上的酶蛋白组成和95％以上的酶活力比例。摇瓶 发酵所用种子的培养方式对漆酶的合成产生一定影响，虽然小规模上固体培养有 利于黑管菌合成漆酶，但液体深层培养可以大量合成漆酶，并从今后的大批量发 酵生产要求的角度考虑出发，选择和确定了主要包括采用72h种子培养、接种量 10％的种子培养工艺条件。液体培养烟管菌发酵生产漆酶过程中，酶的合成与菌体 生长过程紧密相关，符合中期偶联型合成的产酶规律；同时，也体现出在整个生 长过程中该黑管菌以一种组成型酶的生物合成过程产生漆酶。 葡萄糖和淀粉组成的复合碳源、氯化铵和豆饼粉组成的复合氮源有利于漆酶 的合成，而含有比较丰富的生长因子的麸皮盐酸水解液是漆酶高产的一个十分重 要的因素。同时，控NKH2P04的浓度为1．0g／L、适当降低M92+、微量添；bNCu2+的 含量均显著地促进漆酶的合成，Mn2+、Zn2、+Ca2+等离子对漆酶的合成没有明显的 影响，而Fe2+的存在则明显地抑制了漆酶的合成。利用该优化发酵工艺条件，控制 vvm矛ll添加O．02％消泡剂的条 r／min和通气量容积比约为0．8 温度28。C、搅拌速度200 U／mL以上 件下，连续培养黑管菌WZFF．W-Y11菌株，都可以持续稳定地获得1100 的漆酶发酵生产能力。 另外，作为漆酶的作用底物或其结构类似物，木质素、香兰素等抑制了漆酶 的合成，但是，1．萘乙酸、Q．萘酚、愈创木酚在一定程度上可以有效地促进漆酶的 合成。1．萘乙酸是一种植物生长调节剂，对香菇的生长发育具有促进作用，但在国 内外尚未有关于对真菌漆酶生物合成影响作用的报道，本研究首先发现一定浓度 136 l10U／mL。 1．萘乙酸强烈地促进漆酶的产生，提高幅度接近40％，酶活达到了2 以前，a．萘酚被用作为底物进行白腐真菌是否产生漆酶的定性检测，未见有用做诱 导剂促进漆酶合成的文献报道，本实验也发现了a．萘酚能够很好地促进漆酶的生 物合成能力，对酶合成的