琼脂糖凝胶电泳技术侯云鹏.pptVIP

琼脂糖凝胶电泳 姓名：侯云鹏 学号：2013107014 专业：作物遗传育种 学院：农学院 琼脂糖凝胶电泳原理 琼脂糖凝胶电泳步骤 琼脂糖凝胶电泳注意事项 原理 带电荷的物质在电场中的趋向运动称为电泳。 与蛋白质分子相似，核酸分子也是两性解离分子 ，pH3.5时，碱基上的氨基酸基团解离，而三个磷酸基团中只有一个磷酸解离，整个核酸分子带正电荷，在电场中向负极泳动；在pH8.0-8.3时，碱基几乎不解离，磷酸根全部解离，核酸分子带负电荷，向正极移动。 不同大小和构象的核酸分子的电荷密度大致相同，在自由泳动时各核酸分子的迁移率区别很小，难以分开。所以采用适当浓度的凝胶介质作为电泳支持物，发挥分子筛的功能，使得大小和构象不同的核酸分子泳动率出现较大差异，达到分离目的，在loading buffer的作用下，可观察电泳的进行情况。 凝胶浓度和DNA分子的有效分离范围 电泳缓冲液 电泳缓冲液是指在进行电泳时所使用的缓冲溶液，用以稳定体系酸碱度。常见的核酸电泳缓冲液有：TAE、TBE、TPE和MOPS等。 作用 ： 　①缓冲液在电泳过程中的一个作用是维持合适的pH。电泳 时正极与负极都会发生电解反应，正极发生的是氧化反应，负极发生的是还原反应，长时间的电泳将使正极变酸，负极变碱。一个好的缓冲系统应有较强的缓冲能力，使溶液两极的pH保持基本不变。 　②电泳缓冲液的另一个作用是使溶液具有一定的导电性，以利于DNA分子的迁移，例如，一般电泳缓冲液中应含有0.01-0.04mol/L的钠离子，钠离子的浓度太低时电泳速度变慢；太高时就会造成过大的电流使胶发热甚至熔化。 　③电泳缓冲液还有一个组分是EDTA，加入浓度为1-2mmol/L，目的是螯合Mg2+ 等离子，防止电泳时激活DNA酶，此外还可防止镁离子与核酸生成沉淀。 　　 特点： ①TAE是使用最广泛的缓冲系统。其特点是超螺旋在其中电泳时更符合实际相对分子质量（TBE中电泳时测出的相对分子质量会大于实际分子质量），且双链线状DNA在其中的迁移率较其他两种缓冲液快约10%，电泳大于13kb的片段时用TAE缓冲液将取得更好的分离效果，此外，回收DNA片段时也易用TAE缓冲系统进行电泳。TAE的缺点是缓冲容量小，长时间电泳（如过夜）不可选用，除非有循环装置使两极的缓冲液得到交换。 ②TBE的特点是缓冲能力强，长时间电泳时可选用TBE，并且当用于电泳小于1kb的片段时分离效果更好。TBE用于琼脂糖凝胶时易造成高电渗作用，并且因与琼脂糖相互作用生成非共价结合的四羟基硼酸盐复合物而使DNA片段的回收率降低，所以不宜在回收电泳中使用。 ③TPE的缓冲能力也较强，但由于磷酸盐易在乙醇沉淀过程中析出，所以也不宜在回收DNA片段的电泳中使用。 配制方法: 　　 50×TAE Buffer(pH8.5) 配制方法： 　1. 称量Tris 242g，Na2EDTA·2H2O 37.2g 于1L烧杯中； 　2.向烧杯中加入约800ml去离子水，充分搅拌均匀； 　3.加入57.1ml的冰乙酸，充分溶解； 　4.加去离子水定容至1L后，室温保存。 　 10×TBE Buffer(pH8.3)配制方法： 1.称量Tris 108g，Na2EDTA·2H2O 7.44g，硼酸 55g 于1L烧杯中； 2.加入约800ml去离子水，搅拌均匀； 3.加去离子水定容至1L，室温保存。 loading buffer loading buffer 的中文名字是上样缓冲液,6×的缓冲液中可以显示两条带，前面的蓝色的条带是溴酚蓝，代表的片段大小是 300bp，后面的有点绿色的条带是二甲苯青，代表的片段大小在4000bp左右。 　　loading buffer的功能主要有两个。第一，里边的指示剂溴酚蓝和二甲苯酚起到指示的作用，显示电泳的进程，以便我们适时终止电泳；第二，里边的成分甘油可以加大样品密度，使样品密度大于TAE，从而沉降到点样孔中，防止样品飘出点样孔。另外，有的Buffer是加有SDS的，一般都会写明。SDS主要是促使聚合酶变性，因为没有除尽的聚合酶会结合在DNA双链上影响它的迁移速率。　　 6×loading buffer 一般组份： 　 30mM EDTA 　　 36%(v/v) Glycerol （甘油） 　 　0.05%(w/v) Xylene Cyanol FF （二甲苯青FF） 　　 0.05%(w/v) Bromophenol BLUE (溴酚蓝） 步骤 ①凝胶制备：根据实验要分离DNA的范围确定琼脂糖的浓度称取适量琼脂糖,用 TAE or TB