蛋白质凝胶电泳.docVIP

蛋白质凝胶电泳????聚丙烯酰胺凝胶电泳（polyacrylamide gel electrophoresis，PAGE），是目前对蛋白质进行分离、纯度鉴定及分子量测定的主要方法之一。十二烷基磺酸钠（SDS）是一种阴离子去污剂，可与蛋白质结合，使蛋白质变性并带上大量负电荷。SDS是最常用的凝胶电泳技术。它通常采用不连续电泳系统，即用上层胶（成层胶）和下层胶（分离胶）两种不同浓度的凝胶灌制凝胶板，见图2.SDS通过其电荷效应、浓缩效应和分子筛效应，达到蛋白质高分辨率的分离效果。 图2 SDS凝胶分层示意图 ??? ?待分离蛋白质样品在电泳中的泳动速度，或相对迁移率（Mr）与蛋白质本身性质（如分子大小）、凝胶孔径和电泳条件（如电流、电压）等密切相关，蛋白质结合大量的SDS后，各组分之间的的形状和电荷差异被抵消，此时蛋白质在电场中泳动速度的快慢，仅与各自分子量的大小有关。因此，可根据下列公式计算分子量大小: lgMW=lgK—bMr ????其中，MW为蛋白质的分子量，K为常数，Mr为相对迁移率，b为斜率。将已知分子量的几种标准蛋白质在电泳中的相对迁移率对其分子量的对数做图，即可得到一条蛋白质分子量校正曲线。根据待测样品的相对迁移率，可由校正曲线查到其分子量大小，蛋白质样品中加SDS煮沸后，蛋白质发生变性，为保护和还原二硫键，尚需加还原剂2-巯基乙醇（2-ME）或二硫苏糖醇（DTT）。蛋白质变性使亚基聚合形式存在的蛋白质解聚成单个亚基。因此，对于一个纯化蛋白质，可经SDS确定其亚基种类、数目及大小。上述蛋白质分子量测定更确切地说是蛋白质分子各亚基分子量的大小。????丙烯酰胺凝胶孔径对电泳速度及分离效果影响很大。凝胶孔径的大小取决于丙烯酰胺（Aery）单体及N，N—亚甲基双丙烯酰胺（Bis）的含量及比例。总胶浓度（T）可在3％～30％范围内变动，T为8％～15％的凝胶，适用于大多数蛋白质样品的分离。交联度（C）是反映凝胶聚合情况的一个指标。凝胶聚合过程中，Acry单体之间形成延伸的多聚链，并通过Bis的作用，连接和交叉成网状结构，最终成为肉眼可见的凝胶。催化剂过硫酸铵（APS）和加速剂四甲基己二胺（TEMED）直接影响凝胶聚合质量。二者加量过多，会使Acry单体聚合链较短，聚合不充分，胶的脆性增加；反之，如加量过少，则聚合速度大大降低，甚至只出现所配制的胶溶液黏度稍增加、无胶状物出现的现象。见图3. 图3 相对迁移率与分子量对数关系简图 ????根据电泳的目的和要求及样品的特点，可采取恒流或恒压条件进行电泳。????由于印迹技术需将蛋白质成功地从胶中转移至膜上，因此，选择合适的凝胶甚为重要。一般情况下，丙烯酰胺和交联剂的比例越低，转移就越易进行。超薄胶转移的速度快，而且彻底。通常，应根据目的选择厚度、大小均适合的凝胶。若想寻求蛋白质的最佳分辨力，长胶的效果较好，使较大分子量的蛋白质更好地分离。若想达到最大的灵敏度，胶的厚度可增加到1.5mm，并且在不发生变形的前提下，尽量提高蛋白的上样量。若主要考虑的是分离速度，则选用微型胶，厚度为0.5mm。表1显示SDS聚丙烯酰胺凝胶的有效分离范围。 表1 SDS聚丙烯酰胺凝胶的有效分离范围