奶牛诱导型热休克蛋白70基因片段的克隆及其在大肠杆菌中的表达.pdfVIP

16 中国兽医杂志 2008年(第 44卷)第 1l期 奶牛诱导型热休克蛋白70基因片段的克隆 及其在大肠杆菌中的表达 田中杰 ，田文儒 ，姜同泉 ，任登 良 ，王明志 ，屈平平 (1．青岛农业大学动物科技学院，山东 青岛 266109；2．聊城市动物疫病预防与控制中心，山东 聊城 252000) 中图分类号：$852．4 文献标识码 ：A 文章编号：0529—6005(2008)11—0016—02 热休克蛋 白(Heatshockproteins，Hsp)是细胞 TTACAGTCTGCTGATGATG3，其中P1下划线 受应激后产生的一类蛋 白质，其中最重要的、高度保 处为EcoRI酶切位点 ，P2下划线处为 HindⅢ 酶 守的一类热休克蛋 白是 HspTOl1。HspTO一1A 和 切位点。上述引物由TaKaRa公司合成。 HspTO1B几 乎 被 相 同 的基 因编 码 ，被 统称 为 1．3 牛诱导型 HspTO基因序列的扩增及鉴定 牛 HspTO(Hsp72或 iHspTO)。HspTO在未应激正常 血DNA的提取按 Promega试剂盒使用说 明进行。 细胞或组织 内以较低的不可检测到的低水平表达， 扩增体系(25 L体系)：1．5 L模板 ，2．5 L1O× 当机体发生生理变化或遭受应激后会被诱导而迅速 PCRBuffer，2．0肚L 2．5reotol／LXdNTPMixtu 表达 ，因此被称为诱导型 Hsp70。HspTO的分子生 er，2Opmol／t~L上 、下游引物各 0．5 L，0．25 L5 物学功能主要是分子伴侣作用 、抗氧化作用、参与机 U／t~LrTaqDNA聚合酶，17．75 IddH2O。扩增 体免疫作用 、抑制细胞凋亡作用等 一。Hsp70在哺 条件为：95℃ 5min，94℃ 1min，60℃ 40S，72℃ 乳动物的配子发生、胚胎形成的细胞分化、胚胎发育 1rain，3O个循环 ，最后 72℃延伸 10rain。 和细胞周期调控过程 中也扮演重要角色 j。 将 回收后 的PCR产物和测序载体 pMD-18T 人源 HspTO蛋 白已通 过 pET系统成 功地表 连接 。将连接产物转化 E．coliDHScc感受态细胞 ， 达，并具有抗原性和生物活性 ]。目前 ，文献中相关 培养后挑取 白斑摇菌 ，将菌液送至上海联成生物有 报道甚少 。蔡亚非^ 曾对牛源 Hsp70基 因以pET 限公司测序，验证扩增序列是否正确。 系统作载体进行原核表达，其他有关牛源 Hsp70基 1．4 重组质粒 pET一32a—c(十)-c的构建及鉴定 因克隆和表达的研究未见报道。本试验 目的是利用 提取鉴定为阳性的菌液 中的质粒，用 限制性 内切酶 基因重组技术得到诱导 型 Hsp70，为进 一步研究 EcoRI和 HindⅢ 双酶切该 阳性质粒和原核表达 Hsp70的生物学作用和研制 HspTO的单克隆抗体 载体 pET一32a—c(+)，胶回收 目的基因和切开后的载 奠定基础 。 体。将 目的基因及载体用T4DNA连接酶进行连接 ， 1 材料与方法 构建表达质粒 pET-32a—c(+)-c。pET32a—c(+)-c转 1．1 菌种及主要试剂 E．coliDH5。、【E．coliBL21 化 E．coliDHSc~感受态细胞，挑取单个菌落，培养过 (DE3)均 由本实验室保存。pET一32a—c(+)由本实 夜。提取阳性菌液中的质粒进行 PCR鉴定。 验室保存 ，测序载体 pMD一18T、Taq酶、限制性 内切 1．5 IPTG诱导重组蛋 白的表达 将原核表达质 酶 E∞RI和 HindⅢ 和 T4DNA连接酶均购 自 粒 pET32aC(+)