重组人干扰素βser-%2717-的制备及其对SARS病毒的抑制作用.pdfVIP

3．重组人干扰素pser盯的制备及其对SAILS病毒的抑制作用 张振龙1刘建源1扬云凯2邓宛明1崔春青1王淑芳1汤燕文。赵建英1 (1北京生物制品研究所北京100024：2北京天坛生物制品股份有限公司北京100024) 制作用进行研究。方法通过发酵收集菌体，经高压匀浆破碎收集包涵体、有机溶剂抽提、酸沉淀、 研制出了rhlFNl7．ser”纯品，为进一步的临床研究奠定了基础。 、(单位她址r讯痿翻璃邗眍=伺谤南里干号北京生物制品研究所中试一室i —孵编}4∞嘎14卜乓啸～“帅}6朝控挎士¨53手卜 关键词：重组人干扰暴《主互=渤SAR，S国状病毒 V ’ 、 ／’。／ 人IFN．口属于l型干扰素，具有广谱的抗病毒、抗肿瘤和免疫调节作用．临床上主要用于多发性 后在大肠杆菌中获得高效表达，其比活性和稳定性大大超过大肠杆菌表达的天然人[FN．13。经过发酵、 研究结果报告如下。 材料与方法 1．材料 G-75层析介质和蛋白质标准均购自 国际标准品由英国NIBSC提供，SephacrylS-200、Sephadex Phamatcia公司，Lowry检测试剂购自SIGMA公司，所用化学试剂均为进口或国产分析纯。 2．工程菌的发酵培养 取冻存菌种划线接种于LB(含50mg／LAmp)琼脂乎扳中，37℃活化过夜，挑选单菌落接种丁-岔 LB的三角瓶中，37C、培养过夜。次日．将种子 LB的试管中．37C培养10h，然后转种至含200ml 养4h，离心收集菌体、称重。 3．菌体破碎与粗提 mmol／L PB溶解后，加入等体积的仲J醇 15min，收集包涵体沉淀，用I％SDS、10mmol／L盯rr、10 -，4_ 进行抽提，4000rpm／min离心10rain，收集上层有机相，用1NHCI调节pH至5．0，然后离心．收集沉 淀．称重，此即为粗制干扰素。 4．rhlFNl3ser”的精纯化 4．1 S-200凝胶装入色谱柱中．去热原后，用 SephacrylS-200层析纯化将保存的Sephaeryl 50ram、pH5．5的醋酸缓冲液平衡，将酸沉淀的溶解液上样，收集洗脱液，通过SDS检测。 4．2 G一75凝胶装入色谱柱中，去热原后，用 SephadexG-75色谱将充分浸泡后的Sephadex 存符合要求的rh[FN-131b部分。 5． rhIFNp∞r”的理化特性分析 5．1干扰素效价测定采用VSV-WISH系统按细胞病变抑制法测定。 5．2 SDS分离胶15％．浓缩胶5％，上样量10pg，考马斯亮蓝R．250染色。 5．3紫外吸收光谱分析扫描波长范围为200～300rtm。 5．4蛋白含量涓定采用Lowry法测定 5．5分子量测定 采用还原型sDS_PAGE 5．6其它分析项目均按中国生物制品规程进行。 6．rhlFNllser”对SARS病毒的抑制试验 采用细胞病变抑制法。用细胞生长液将rhlFNl＆ser”连续4倍稀释至4．”，加入己长成单层的Vero．E6 计算能够抑制50％细胞病变的干扰素浓度(即Ec，o)。 结 果 1．工程苗的发酵培养与产物表达 工程菌经IPTG诱导表达后．与诱导前相比有明显的目的蛋白带表达，见圈l。SDS．PAGE电泳凝 理论值相符，工程菌发酵后的收获量为13．08 g，L培养液。 l 2 3 4 5 图1发酵菌体表达rhlFNl3s