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大肠杆菌高活性氨基酸生物合成途经研究.doc
研究目的：
汽油替代品：高能量密度、低吸湿性、辛烷值
传统生物燃料高级醇；直链醇支链醇
研究菌体：大肠杆菌
方法技术：
代谢工程：高活性氨基酸生物合成途经+埃利希途径Ehrlich pathway）
葡萄糖→2-酮酸中间体→高级醇（异丁醇、1-丁醇2 -甲基- 丁醇
实验部分：
一、异丁醇
前期实验：
1）2-酮酸是氨基酸生物合成途径的中间产物；通过2-酮基酸脱羧酶醇脱氢酶PLlacO1启动子控制的ilvIHCD基因被过度表达以增大2-酮异戊酸Kivd 和Adh2）。
菌株可产生出23 mM异丁醇，这约是普通菌株产量的五倍
3）进一步提高异丁醇的产量，需要删除控制合成副产物的基因，包括adhE，ldhA，frdAB，fnr 和pta。这些基因的删除可提高用于ilvIHCD合成途径的丙酮酸的量。
敲出基因后的菌株产生了30 mM异丁醇。
4）选用枯草芽孢杆菌alsS基因取代大肠杆菌的ilvIH基因。相比于大肠杆菌更偏向酮丁酸ilvIH基因，alsS基因对丙酮酸盐有更强的亲和力。
采用alsS途径的菌株可产生约50 mM的异丁醇。
5）为进一步增加丙酮酸盐的量，pflB基因被敲出。
在这些操作的综合作用下，可以在微好氧条件下使异丁醇的产量达到约300mM (22 g/l)。
实验结果：
通过此种方法由葡萄糖获得了高产量、高选择性的异丁醇
二、正丁醇
1）1-正丁醇的前提2-酮基戊酸乙酯不是大肠杆菌的代谢物。，作者尝试以与亮氨酸生物合成途径相似的方法，以一种分子比2-ketovalerate少一个甲基的更小的分子——2-酮丁酸为底物，合成2-ketovalerate。2-酮丁酸可以通过由ilvA基因编码的苏氨酸脱水酶作用苏氨酸生成。
2）为进一步提高1-丁醇的产量，编码二羟酸脱水酶ilvD被敲除。二羟酸脱水酶缬氨酸ilvD基因的敲除避免了leuABCD代谢途径的自然底物2-酮基异戊酸的生成，进而抑制了目的产物的竞争底物。其次，ilvD基因的敲除避免了Kivd的竞争底物2-酮酸-3-甲基-戊酸和 2-酮酸-4-甲基戊酸的产生。故而ilvD基因的敲除进一步增加了1-丁醇的产量。
三、提高耐受性
为了探索耐受性的可提高程度，我们对于正丁醇耐受性的菌株进行传代培养。我们发现，原生的大肠杆菌对于正丁醇的耐受性为1.5%。然而，菌株在正丁醇浓度不断增加的环境下进行传代培养五代之后，便会出现对正丁醇的耐受性达到2%的基因突变菌株（补充材料中的图4）。这种菌株的耐受性可达到与1-丁醇的原生生产者相当或甚至优于原生生产者。
证明大肠杆菌可以适应长链醇类的高浓度环境。之后还可以运用诸如全转录工程（gTME）等其他的方法进一步提高耐受性。
优势：
本方法使用大肠杆菌作为研究菌体，但这种方法可以在诸如酿酒酵母菌辅酶A介导的化学
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