实验五：蛋白质的浓度测定Bradford法.pptVIP

实验五：蛋白质的浓度测定——Bradford法 一、实验目的 掌握Bradford法测定蛋白质浓度的原理和操作技术。学会熟练、正确使用分光光度计。 二、实验原理 考马斯亮蓝法又称Bradford法，它是根据蛋白质与染料相结合的原理设计的。这是一种迅速、可靠的通过染色法测定溶液中蛋白质浓度的方法。尽管相对于其他方法来说，此法的干扰物质较少，但由于每种蛋白与该染料的结合能力不尽相同，故标准品的选择非常重要，选择尽可能与待测蛋白一致的样品做标准，能最大限度地提高该方法的准确性。Bio-Rad公司的蛋白质定量检测试剂盒即以此法为依据。 考马斯亮蓝G250有红、蓝两种不同颜色的形式。在一定浓度的乙醇及酸性条件下，可配成淡红色的溶液，当与蛋白质结合后，产生蓝色化合物，反应迅速而稳定。经研究认为，染料主要是与蛋白质中的碱性氨基酸（特别是精氨酸）和芳香族氨基酸残基相结合。反应化合物在595nm处有最大光吸收，化合物颜色的深浅在一定范围内与蛋白质浓度成正比，因此可通过测定595nm处的光吸收值来计算蛋白的含量。 Bradford法的突出优点是：（1）灵敏度高。据估计比Lowry法（Folin-酚试剂法）约高4倍，其最低蛋白质检测量可达1mg。这是因为蛋白质与染料结合后产生的颜色变化很大，蛋白质-染料复合物有更高的消光系数，因而光吸收值随蛋白质浓度的变化比Lowry法要大得多。（2）测定快速、简便，只需加一各试剂。完成一个样品的测定，只需要5min左右。由于染料与蛋白质结合的过程大约2min即可完成，其颜色可以在1h内保持稳定，且在5～20min之间，颜色的稳定性最好，因而完全不同像Lowry法那样费时和严格地控制时间。（3）干扰物质少。如干扰Lowry法的K+、Na2+、Mg2+离子，Tris缓冲液，蔗糖、甘油、巯基乙醇、EDTA等均不干扰此测定法。Bradford法的缺点是：（1）由于各种蛋白质中的精氨酸和芳香族氨基酸的不同，因此Bradford法用于不同蛋白质测定时有较大的偏差，在制作标准曲线时通常选用g-球蛋白为标准蛋白质，以减少这方面的偏差。（2）仍有一些物质干扰此法的测定。主要的干扰物质有：去污剂TritonX-100、十二烷基磺酸钠（SDS）和0.1mol/L的NaOH（如同0.1mol/L的酸干扰Lowary法一样）。（3）标准曲线也有轻微的非线性，因而不能用Beer定律进行计算，而只能用标准曲线来测定待测蛋白质的浓度。 三、实验器材 1、VIS-7220型可见分光光度计： 操作：插上电源插头，打开电源，调节“波长调节旋钮”使波长显示窗中的数 字为所需的波长,推开比色室的盖子。将空白和样品溶液分别倒入比色皿中（倒 入之前先用少量蒸馏水，再用少量待测溶液各润洗比色皿一次），用擦镜纸擦 净比色皿表面，将比色皿插入比色室里的卡座中。拉动卡座拉杆，将空白液的 比色皿置于光路中，按一下“MODE”键，使“%T”的指示灯亮，在比色室的盖 子打开的状态下按一下“0%T”键，使显示窗中的数字为0.0。关闭比色室的盖 子，按一下“100%T ABS 0”键，使显示窗中的数字为100.0。这样，仪器就调 整好了。再按一下“MODE”键，使“ABS”指示灯亮，按一下“100%T ABS 0” 键，使显示窗中的数字0.000。拉动卡座拉杆，将样品液的比色皿置于光路中。 此时，显示窗中的数字即为样品的吸光度。注意，每次测定下一个样品之前都 需要用空白重新调校“0%T”和“100%T”。测定完后，将比色皿中的溶液倒入 原试管中（以备测错了重测），先用自来水将比色皿内外冲洗干净，再用洗瓶 冲洗比色皿的内外表面1次，将其粗糙面朝下斜靠在培养皿中。不测定时，请将 比色室的盖子打开。但注意改进型的VIS-7220型可见分光光度计，在调整“0%T ”时需要关闭比色室的盖子，将比色皿卡座最前端的挡板置于光路中，按“0%T ”时需要关闭比色室的盖子，将比色皿卡座最前端的挡板置于光路中，按“0%T ”键可将“T”调为0%。 关于比色皿：比色皿的前后有2个光滑面，是用来对准光路的；左右有2个粗糙面，手只能拿比色皿的粗糙面，不能接触光滑面。比色皿内部的清洗只能用蒸馏水润洗（用洗瓶），不可用纸或其他物品捅进去擦洗。比色皿的2个光滑面一定要保持清洁，如发现有指纹或残液，须用擦镜纸轻轻擦拭干净。比色皿是成套发放的，严禁混用。本实验使用的是玻璃比色皿，一套4只。使用完毕后先用40%乙醇润洗干净，再用自来水内外冲洗干净，最后用洗瓶冲洗，将其粗糙面朝下斜靠在培养皿中。2、试管及试管架：10支/组。3、5mL移液管。4、微量进样器（100μL）：1支/组。 四、实验试剂和材料 1、标准蛋白质溶液：用牛血清白蛋白（BSA）作为标准蛋白。称取B