人血管生成素基因的克隆及表达.pdfVIP

维普资讯 第40卷第2期 东 北 师 大 学 报 (自然 科 学 版 ) V0l1．40No．2 2008年 6月 JournalofNortheastNormalUniversity(NaturalScienceEdition) June2008 [文章编号]1ooo．1832(2008)02—0101—04 人血管生成素基因的克隆及表达 姜春华，邱 田，于德海，杨 琼 ，王 丽 (东北师范大学遗传与细胞研究所，吉林 长春 130024) [摘 要] 利用RT—PCR方法从培养的人黑色素瘤细胞系A375中扩增得到了人血管生成素 eDNA片段，测序正确后克隆入表达载体 pET一28a(+)中并转化于E，coliBL21宿主菌中．经 IPTG诱导，表达 了N端融合6个组氨酸标签(6His—tag)的血管生成素融合蛋 白，利用6His—tag 与过渡态金属离子Ni2高亲和力结合的性质，经镍柱纯化，获得 了高纯度的血管生成素融合 蛋 白，为进一步研究其生物活性及应用奠定 了基础． [关键词] 血管生成素；基因克隆；基因表达 [中图分类号] Q786 [学科代码] 180．7110 [文献标识码] A 血管生成素(angiogenin)是一种相对分子质量约为14400的单链碱性蛋 白，其主要生理活性是促 进新生血管生长，并兼有较弱的RNA酶活性l1J．1985年，美国哈佛大学医学院的Fett等人首次从人结 肠腺癌HT一29细胞条件培养基中分离出了血管生成素[．随后的研究表明，不同来源的肿瘤组织及肿 瘤细胞系中均有血管生成素mRNA的表达，在肿瘤发生的不同阶段，刺激新生血管的形成[0；而且，肿 瘤患者血清中血管生成素水平高低与肿瘤的恶性程度密切相关[4-5]．为了获取足够量的人血管生成素 以供其生理功能、抗原特性及潜在的临床应用等方面研究，我们利用 RT—PCR技术从人黑色素瘤细胞 系A375中扩增得到了人血管生成素eDNA片段，并将它克隆入带有纯化标签的表达载体pET一28a(十) 中进行表达 ． 1 材料与方法 1．1 材料 人黑色素瘤细胞系A375、质粒pET-28a(+)和菌种DH5a及BL21为本实验室保存．分子生物学试 剂购 自北京鼎国公司及大连宝生物公司． 1．2 方法 1．2，1 PCR引物 PCR引物根据人血管生成素成熟肽 eDNA序列设计合成．P1为5’引物，序列为：5-CGCA3ATCC CAGGATAACTCCAGGTACACAC-3；P2为3’引物，序列为：5-CC12AAGCTTTACGGACGA CGGACGGAA TG-3．两条引物分别含有BamH工、HindⅢ酶切位点，5端含有保护碱基CG，3端 含有保护碱基CCC．由中科院上海生物工程研究中心合成． 1．2．2 细胞培养 将冻存的人黑色素瘤细胞系A375复苏，隔天换液，3～5d传代一次，至贴壁生长细胞数达到 106个 左右 ． [收稿 日期】 2007—12—20 [基金项 目】 吉林省科技发展计划重点项 目02)． [作者简介】 姜春华 (1980一)，女，硕士研究生；王丽 (1957一)，女，博士，教授，博士研究生导师，主要从事基因工程、植物细胞工 程、肿瘤发生机制研究． 维普资讯 102 东北 师 大 学报 (自然科 学版) 第40卷 1．2．3 RT-PCR扩增 目的基因片段 收集细胞，用 Invitrogen公司的Trizol试剂提取总RNA，用Promega公司的逆转录试剂盒进行RT- PCR，逆转录得到cDNA．以cDNA为模板，加入 P1、P2、无菌水和Taq酶，进行PCR扩增反应．取 1止 PCR产物在 1％琼脂糖凝胶中进行电泳，验证PCR扩增结果． 1．2．4 重组表达质粒的构建 纯化后的PCR扩增产物及载体pET-28a(+)，经Bam