表达载体的构建.pptVIP

中国海洋大学 科学馆319 表达载体的构建  穆小生   2011.11.3 一 表达载体介绍 二 构建表达载体的基本步骤 三 载体构建具体范例 四 构建表达载体注意事项 一 表达载体的介绍 1.载体的分类： 1.1 按进入受体细胞类型分： （1）原核载体 （2）真核载体 （3）穿梭载体 1.2 按功能分成： （1）克隆载体：通常都带一个松复制子、一个多克隆位点和一个筛选标记，目的在缩主细胞内复制形成大量的基因克隆，被克隆的基因不表达 。 （2）表达载体：就是在克隆载体基本骨架的基础上增加表达元件（如启动子、 RBS 、终止子等）使目的基因能够表达的载体。 ?? 是否含有表达系统元件，即启动子--核糖体结合位点--克隆位点--转录终止信号，这是用来区别克隆载体和表达载体的标志。 二 构建表达载体的基本步骤 引物设计 模板与线性化质粒连接 三 载体构建具体范例： 大菱鲆GHR基因构建入pEGFP载体中 1. GHR从大菱鲆cDNA模板中扩增 2. 分析酶切GHR基因酶切位点 将GHR基因mRNA序列的CDS区（蛋白编码区）导入 DNAMAN 软件中，进行酶切位点分析： 3. 引物的设计 引物直接在GHR编码区起始和末端设计,然后在引 物5’端加上相应的酶切位点。 4. GHR PCR 扩增，纯化，EcoRI和SacII酶切，纯化 5.质粒提取纯化, EcoRI和SACII酶切线性化，低浓度琼糖电泳，胶回收纯化 6.模板与线性化质粒连接 7.转化感受态大肠杆菌 8.鉴定（PCR、双酶切和测序鉴定） 四 构建表达载体注意事项 1. 尽可能除去无关的DNA序列 从而增加载体容量。 2. 选择表达载体时，要根据所表达蛋白的最终应用考虑。如为方便纯化，可选择融合表达；如为获得天然蛋白，可选择非融合表达，融合表达时在选择外源DNA同载体分子连接反应时，对转录和转译过程中密码结构的阅读不能发生干扰。 3. 选择的酶切位点在靶基因上没有相应的酶切序列，否则在构建重组子进行酶切时会把靶基因给切开。 4. 在惠赠或交换的质粒中确定MCS的正确性，否则会造成错读密码子 3 对照的设立 为验证双酶切是否成功，可做如下对照： （1） 酶切反应时加各单酶分别切两管，用同一种Buffer，跑胶，看单切的两管是否成线性.如两管均成线性可初步判断双酶切成功。 　做转化时，也要进行对照： （2）即拿双酶切的质粒产物也进行连接反应，这个对照可进一步看双酶切是否成功，如果长出克隆，说明很有可能只进行了单酶切，如没长出克隆，则证明双酶切成功。 （3）酶切过的未进行连接反应的双酶切产物，进行转化，这一步可以证明是否有残留的未被任何酶切的原始质粒 。 （4）设原始质粒为对照，意为检测整个操作过程中是否有误。 谢 谢 * 中国海洋大学 科学馆319 目的基因(CDS区）的克隆 目的基因进行酶切 质粒进行酶切线性化，电泳，胶回收纯化 a遵循引物设计原则; b引物两端加入酶切位点； c保证引物序列扩出的靶基因插入到表达载体MCS上，能够正确读码； 一般先用PCR扩增带酶切位点的目标基因，然后用与消化载体相同的内切酶进行消化和胶回收。 转化到大肠杆菌DH5α 鉴 定（PCR,测序,酶切） 通过PCR选出阳性克隆，测序鉴定表达载体是否构建成功 将表达载体导入表达菌株 5‘非翻译区 3‘非翻译区 CDS区 初次PCR引物设计（外引物） 内引物 特别注意：1.因为需要与GFP融合表达，所以下游引物要去掉终止密码子TGA 2.不要改变GFP表达的编码框 Forward 5’- ATGCCACTAAGCACAGCTG -3’ GAATTC CC Reverse 5-’ TCAGTTCACAGAGTGGCA -3’ CCGCG