酿酒酵母不对称遗传分析(设计).docVIP

酿酒酵母不对称遗传分析 生物科学 10300700042 周博言 周五下午108 注：这个实验设计我上传了百度文库，老师如果在百度发现和我这个一模一样的设计不要误会，那个就是我设计的，不是我抄袭。 原理 在酵母细胞出芽过程中，细胞衰老造成的损伤在母细胞和子细胞之间的分配是不对称的，绝大部分损伤被母细胞所保留。然而，这种不对称遗传也不总是这样，在母细胞衰老到达一定程度时，它所产生的子细胞将不可避免地带有母细胞的部分衰老物质。 酿酒酵母很早就被当做研究衰老的模式生物，早在1989年，Egilmez和Jazwinski就提出了“细胞质衰老因子”假说。1997年，Sinclair等人提出了酵母复制衰老的ERC积累学说，认为染色体外rDNA环——ERC可能就是“细胞质衰老因子”。酿酒酵母rDNA座占整个基因组的10%，由编码rRNA的9.1kb重复单元串联重复100~200个拷贝组成，定位于染色体ⅩⅡ。ERC可以通过胞内DNA加工系统的作用，由串联重复的rDNA经同源重组从基因组中切出。而ERC具有自身ARS（autonomously replicating sequence），能在每一次S期复制1次，而在母细胞内呈指数型增长。同时由于酵母细胞出芽分裂的不对称遗传，ERC在分裂时保留在母细胞中而不进入子细胞，从而使母细胞中大量积累ERCs。但随着母细胞持续地衰老，这种不对称遗传将无法维持下去，最终极度衰老的母细胞产生的子细胞中也将不可避免地带有ERCs。 本实验将通过培养酿酒酵母，分离检测ERCs，对比不同代数母细胞产生的子细胞及衰老母细胞中ERCs的含量，验证酿酒酵母的不对称遗传。 注： 关于ERCs的不对称遗传的机制，Shcheprova等人提出了一种氯苄乙胺依赖的细胞核扩散屏障，它阻碍了母细胞核孔通向子细胞的通道。而环形DNA分子，比如ERCs，缺乏一种着丝粒序列而无法通过该屏障，最终被留在了母细胞中。 尽管ERCs如何造成酵母细胞衰老的机制尚未明确，但很多假说已被提出。一种猜测是，ERCs会与那些在复制、转录过程中起重要作用的因子发生物理上的相互作用，从而使它们无法行使正常的功能。另一种可能性是，过多的ERCs导致了rRNA和核糖体蛋白之间数量的不平衡，进一步削弱了核糖体其本身的功能。而Ganley等人的研究则认为，ERCs通过诱导rDNA使其不稳定性限制了酵母细胞的RLS（复制型寿命），并且，他们认为这正是衰老的最根本的原因。 材料 酿酒酵母细胞 培养基1（单位均为g）：葡萄糖25、酵母浸粉2、（NH4）2SO42、KH2PO45、MgSO4?7H2O0.4、CaCl20.2、1000ml蒸馏水 培养基2（单位均为g）：葡萄糖10、酵母浸粉2、（NH4）2SO42、KH2PO45、MgSO4?7H2O0.4、CaCl20.2、1000ml蒸馏水 仪器与试剂 仪器 恒温摇床，高速离心机，振荡器，电泳仪，电泳槽，透视式紫外分析仪（或凝胶成像仪），离心管，摇瓶 试剂 蔗糖、酵母质粒小提试剂盒中相关试剂（北京庄盟国际生物基因科技有限公司，也可采用其他公司试剂盒，那样步骤中数值可能要作改变）、琼脂糖、溴化乙锭等 操作程序 酵母细胞的培养与分离 活化：取适量酵母菌体，接入培养基1的摇瓶中，于30℃在150r/min摇床中培养24h，菌体密度约为4×107个/ml。 蔗糖梯度制备：于15ml（内径1.4cm，长11cm）离心管中自上而下铺加40%蔗糖溶液1.5ml，再加20%、10%及2%的蔗糖溶液各3ml制成不连续梯度。 离心筛选：收集菌液，在800g离心力下离心5min，收集菌体重悬于1.5ml无菌水中。将菌体铺在蔗糖梯度溶液顶层，60g离心5min，收集最上层清液（约占总体积5%~10%），得到的为刚脱离母体的芽殖细胞。 同步培养：将得到的菌液转入50ml培养基2摇瓶，30℃下150r/min摇床中培养。 ERCs的提取（参照部分质粒提取操作，部分地方改动以适应ERCs的提取） 取1-5 ml 酵母培养物（不超过5×107 酵母细胞），12,000 rpm (~13,400×g )离心1分钟，尽量吸除上清（菌液较多时可以通过几次离心将菌体沉淀收集到一个离心管中）。 酵母细胞壁的破除：酶法：向菌体中加入300 μl Lyticase buffer，充分混匀，并在摇床上220rpm/min，30℃处理1 小时。4000 rpm(~1500×g)离心10 钟，弃上清，收集沉淀。加入250μl 溶液1（请先检查是否已加入RNaseA）重悬沉淀。注意：根据酵母菌株和酵母细胞数量的不同，所用Lyticase buffer 的浓度和孵育时间应该进行适当调整。 向管中加入250 μl 溶液2，上下翻转6–8 次使菌体充分混匀，室温放置5－10 分钟。