高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒分离鉴定及毒力变异机制初探.pdfVIP

疫病防治 PRRSV为不分节段、聚腺昔酸化、有囊膜的单股正链RNA病毒。其基因组长度约为15Kb，含有9 左右。GP5有6个抗原决定簇，其中～个是血清型特异性线性中和决定簇，能在体外中和病毒的感染 性，可诱导产生中和抗体，能在体外中和病毒，病毒中和作用与抗GP5抗体效价呈显著相关性。不同 地域的分离毒株的序列分析表明，PRRSV有2种基因型，即以ATCC VR-2332毒株为代表的北美洲型 和以Lelystadvirus(LV)为代表的欧洲犁，我凼流行的主要为北美洲璎。 自2006年夏天起，我国南方地区出现了大规模的’无名高热综合征。流行，随后迅速传播到我国 绝大多数省份，至少1000多力．头猪发病，400多万头猪死亡，给我国的养猪业造成了严重的经济损失， 目前此病还在我凼的许多省份暴发。 在山东省的一些猪场也陆续发现无名高热病例，传统疫苗无法起到很好的保护作用，给猪病预防 造成困难，也给养猪业带来重大损失．据专家推测，该病的主要源发病原是变异的PRRS病毒，主要的 变异区是NSP2，主要的变异足NSP2区域的一段氨基酸缺失。 本实验从山东三个发生”无名高热综合征”的猪场病死猪上采集的肾脏、淋巴结、肝脏、肺、扁桃 体等组织，经处理后接种MARC-145细胞，分离到三株高致病性PRRSV变异株，其中对一株进行了动物 回归试验，在此基础上利用分子生物学分析软件对其NSP2和ORF5基冈组信息进行了系统分析，对其 毒力变异机制进行了初步探讨。 1材料与方法 1．1材料 1．1．1病料：2006年12月份在山东三个发生’无名高热综合征”的猪场病死猪上采集的肾脏、淋巴 结、肝脏、肺、扁桃体等组织，经处理后接种Marc-145细胞，按常规方法分离病毒。 j 1．1．2载体与菌株克隆载体PMDl8-T载体购自TaKaRa公司。宿主菌最colDH5d由本实验室保 存 司：反转录酶M-MLV，购自Promega公司，PCR试剂购fjTaKaRa公司。 1．2方法 1．2．1病毒的分离与培养 取组织病料，用生理盐水制成1：10的组织匀浆，加青、链霉素各2000U／mL，置4C冰箱4h后， 养瓶中，37。C吸附lh后，补加营养液至全景，继续培养6天后，将细胞冻融3次，取冻融液llIIL盲 传3-6代，出现典型PRRSV细胞病变。 1．2．2电镜照片 将出现典型CPE的细胞送山东人学电镜室照电镜照片。 1．2．3病毒TCID50的测定 一145细胞的96孔细胞培养板上，每稀释度接8孔，每孔再加入0．1札维持液，封板，放入C0。培 各毒株的TCID‰ 1．2．4 Nsp2部份基因片段及ORF5基因的的克隆及序列分析 洲型ORF5基冈的上下游引物Pss／Pr5，Nsp2部份基因片段引物参照田克恭发表文章，由上海生物 工程公司合成。 Ps：5’TGTGAATTcATGT懈A从1鲫TGA锄’ Pr：5’CCACTCGAGCCTTTTGTGGAGCCGTGCTAT3， 山末青收瞢医学舍井精专盘委员台第一届学术研讨台论文集 盯引物：5LTcGCOcT^^卜， PSxl：FqTOcT从cGGTToGG“G从^c3’ PS】(2：5’-G^黜^6T^TTTT。GGccTGT一3’ 1 2 4 行盯一PCR。 1_24 3PcR产物琏接T载体和阳性克隆的筛选PcR产物经1％琼脂糖凝胶电泳后，用胶回收试 剂盒回收目的片段，连接pMDl80 Vector．转化大肠杆苗DH5d．涂布LB／Amp／Xgal琼脂平板。 挑取白斑摇菌后小晕提取质粒井作PcR鉴定。将鉴定正确的菌种送上海生物工程公司测序。 1．2．5核昔酸及推导氨基酸的同源性及进化树分析 用OmStar和M。肼软件分析所测的核苷酸序列的同源性，井进行推导氨基酸的同源性、变 异及进化树分析。 l_2 6动物回归试验 进PRRSV抗原、抗体均为阴性的健康猪10头，将其随机分为2组，将分离纯化的sn_J}『株 物．每头猪抽1。同时设空内对照组，荐组均分圈饲养．攻毒后每天观察猪H．测量直肠温度。观