ASFV病毒高效纳米PCR检测方法的建立及初步应用.pdfVIP

中国畜牧兽医学会畜牧兽医生物技术学分会暨中国免疫学会兽医免疫分会第九次学术研讨会论文集 ASFV病毒高效纳米PCR检测方法的建立及初步应用 胡泉博，崔尚金+ (中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室／猪传染病研究室，黑龙江哈尔滨150001) 摘 感性的1000倍以上，最低核酸拷贝数检出量可以达到101L数量级。在对中国黑龙江、吉林和河南三个 copy／p 省份的8个地区临床送检的69份样品进行检测，检测结果显示均为阴性，在以上三含地区均未发现ASFV病毒 感染情况。 关键词：非洲猪瘟；P54基因；纳米PCR swine 非洲猪瘟(Africanfever，ASF)又称东非猪 瘟或疣猪病，1921年首先发现予非洲肯尼亚，该病特殊的交叉反应，并在细胞内摄作用及病毒加工过程 swinefever 是由非洲猪瘟病毒(African virus，ASFV)中起重要作用。在感染病毒后的复制早期，病毒可激 引起的一种急性、发热性、高度接触传染性疾病。 活细胞凋亡蛋白酶而诱发细胞脱噬作用【5】。 其临床症状类似于急性猪瘟，主要特征表现为高 目前，对于ASFV检测方法主要包括血清学诊断、 热、皮肤充血、内脏器官广泛性出血、流产以及呼 病原学诊断及分子生物学诊断方法。在分子生物学 吸系统和神经系统功能改变等…。非洲猪瘟病毒传 诊断技术中PCR检测方法由于操作简单，灵敏度 染发病率高，传播速度快且死亡率高，世界动物卫 高、重复性好、污染率低等优点被广泛应用。如A． 生组织(OIE)将其列为A类动物疫病，我国也将其 列为一类动物疫病口1。 别诊断猪瘟和非洲猪瘟。McKillent，】等建立了实时荧 非洲猪瘟病毒(AFsV)属于非洲猪瘟病毒科非光定量PCR分子信标检测方法用来快速检测 洲猪瘟病毒属，是一种有囊膜的双链DNA虫酶病 毒，呈二十面对称结构，直径为175-215nin。其病 技术对ASFV进行检测，纳米PCR技术是一种新型 毒基因组为末端共价闭合线性双链DNA，长度为 的PCR技术，其原理为把粒径为1．100nin的固体 170．190 kb，在基因组末端含有末端交联和反复重 纳米金属颗粒悬浮在液体里形成纳米流体。由于纳 复区。整个基因组含有151个ORF，可以编码米流体相对于普通流体具有更强的热导性，所以在 150．200种蛋白质。目前，已经从ASFV感染细胞中添加了纳米金属颗粒的PCR热循环体系中，PCR反 分离鉴定出80多种病毒蛋白多肽【31。其中P54蛋白应会更快地达到目标温度，减少在非目标温度的停 是由ASFV—E183L基因编码所得，长度约2ku， 留时间，进而缩短整个体系达到温度平衡所用的时 包含一段跨膜区域，主要集中在内质网膜处。可分 间，最终达到消除非特异性扩增，提高特异性扩增 泌至病毒体外，以二硫键连接的I型膜结合物形式 产量的目的【8、91。 感染细胞，而且感染细胞后在内质网膜处短暂表达。 P54蛋白的跨膜结构在病毒蛋白经内质网膜转化成 病毒包膜前体时起十分重要的作用【4】。此外，ASFV 一82一 中国畜牧兽医学会畜牧兽医生物技术学分会暨中国免疫学会兽医免疫分会第九次学术研讨会论文集 1材料与方法 设在0．2ILL～1．2斗L，以每0．2IzL递增，在筛选出 的合适退火温度下进行扩增。反应结束后，PCR产 1．1 试剂盒材料 质粒抽提试剂盒购自美国 物以2％琼脂糖电泳检测。 OMEGA公司，胶回收试剂盒购自上海华舜生物工1．7特异性检测试验分别使用非洲猪瘟病毒 程有限公司，纳米PCR试剂盒购自山东大正医疗器 械股份有限公司。 1．2检测病料背景及来源病料为黑龙江、吉林和 猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、猪捷申病毒 河南三个省份的8个地区送检的69份样品。 1．3 主要试剂 Ex DNA聚合酶、dNTPs、作为模板进行纳米