CIEF%2fpCEC二维联用平台的搭建及其在多肽分析应用.pdfVIP

全国生物医药色谱学术交流会(2010)论文集 D25 CIEF／pCEC--维联用平台的搭建及其在 多肽分析中的应用 魏娟谷雪王彦阎超丰 上海交通大学药学院，上海，200240 关键词，毛细管等电聚焦，加压毛细管电色谱，多肽 加压毛细管电色谱(PressurizedCapillaryElectrochromatographypCEC)整合了毛细管电泳 与液相色谱的优点，采用电压和压力联合驱动力。在双重分离机制的作用下，pCEC对于样品 的分辨能力得到了极大的提高，尤其适用于复杂体系的研究【lJ。毛细管等电聚焦(capillary isoelectric focusingCIEF)则是根据样品的等电点(pI)进行分离，尤其适用于两性物质。同 时该技术还具有快速，高效的特点被广泛应用在蛋白质和多肽的分离分析中。随着蛋白质组 学的发展，一维ClEF的分离效果峰容量远远不能满足蛋白质分离分析的需要，其二维联用技 术成为发展的必然趋势【2J。CIEF／pCEC符合机理正交的要求，将二者的优势相结合，通过多维 联用的分离，可实现更高的峰容量。本项目以毛细管等电聚焦为第一维分离模式，以反相加 压毛细管电色谱为第二维分离模式，开展二维离线色谱联用研究，对复杂肽段进行分离。 1．实验部分 1．1仪器与试剂 ％s印1M-2100GV毛细管电色谱仪、毛细管电泳仪(UnimicroTechnologies，Inc．，USA)； 核糖核酸酶A，碳酸酐酶(上海楷洋生物技术)；牛血清白蛋白(BSA)(上海申能博彩生物 科技)；乙腈(色谱纯)；娃哈哈饮用纯净水；其它试剂为分析纯。 1．2实验方法 1．2．1 ClEF实验条件 i．d．x50 毛细管为HPC涂层毛细管(100Inn cm)，有效长度35cm，末端10cm处制备电 隔离槽。阴极缓冲溶液为20 mrnol／LNaOH含有0．1％HPC，阳极缓冲溶液为20mmol／LH3P04 含O．1％HPC。样品为2％两性电解质、O．I％HPC。进样时用1 mL微量注射器全柱进样。进样 后开启高压电源，对CIEF采用动态聚焦法进行聚焦，电压20 kV，紫外检测波长280nm。 1．2．2 pCEC实验条件 i．d．×20cm，5 用ODS装填的石英毛细管柱(150wn lma)；流动相A(水：乙腈v～--95： 5含0．1％TFA)，流动相B(水：乙腈v／v=5：95含O．1％TIA)，梯度O～5rain，O～5％B；5～ 35 min，5-25％B：35-40 min，25—100％B；泵流速：O．06 mL／min；l止进样环；检测波 长：214 kV。 nm：电压6 1．2．3 cmF／pCtC二维联用 将8．5m#mL的BSA酶解肽段进行ClEF分离，每隔8 min收集一次馏分，共八个馏分。 重复进样5次并收集馏分。将相同时问段收集的馏分合并，然后分别进行第二维pCEC分析。 全国生物医药色谱学术交流会【2010；论文集 2．结果与讨论 一维CIEF分别对两性电解质的浓度，分离电压，添加剂，两极缓液的浓度等条件进行优 mmol／L 化，最终选用添加了0．1％HPC，2％两性电解质的水溶液作为溶剂，20NaOH，H3P04 作为两极缓冲液。选用六种标准蛋白对建立的CIEF方法进行考察，得到很好的分离效果，见 图la。离线联用时，CIEF中样品根据等电