深测序与基因芯片技术用于mRNA表达谱检测的比较研究.pdfVIP

深测序和基因芯片技术用于mRNA表达谱检测的比较研究 冯林1刘宇1刘航2陆志科2高燕宁1张开泰1程书钧1张勇2 (1中国医学科学院北京协和医学院肿瘤医院肿瘤研究所分子肿瘤学国家重点实验室 病因及癌变研究室北京1000212深圳华大基因研究院深圳518083) 摘要：本研究通过检测两种细胞系mRNA表达谱和其中差异表达基因的分析．比较了基因芯片和基于深测序技 术的数字基因表达标签谱(DGE)这两种技术对基因表达谱的检测能力、技术重复性、动态范围和检测结果间的一 致程度．结果显示，基因芯片在对整个转录组的检测能力和在平台内部的重复性方面，均不明显弱于DGE平台．但 基因芯片数据跨平台稳定性差，难以满足多中心研究的需要，且其各方面技术指标无法像DGE随测序深度增加而获 得改善． 关键词，基因表达谱基因芯片测序DGE l背景 基因表达谱研究，是对细胞内某时刻rnRNA表达情况进行全景式的描绘，是人们理解复杂生命 现象的有效途径．毫无疑问，基因芯片技术的诞生．不斥为而今各种“组学”蓬勃发展的奠基之作1。 经过十几年的探索和发展，基因芯片不仅活跃在科研领域，更有部分已经走上临床，为患者服务。 是由Van’tVeer等3发现的用于乳腺癌风险评估的著名的70个基因表达谱。尽管基因芯片取得过如 此成功，然而从技术角度讲，由于其基本原理是核酸问互补杂交，所以存在一些固有缺陷4，比如噪 声背景和交叉杂交等等，是该技术自身无法克服的。 在过去的两年，下一代测序技术(next-generationsequencing sequencingtechnology)，逐渐进入研究者的视线。凭借其飞速、海量的读取能力，深测序技术开始应 Gene 用于许多分子生物学研究领域，其中数字基因表达标签谱(Digital Expressiontagprofiling，DGE) 就是该技术应用于基因表达谱研究的一种形式。该技术通过对样品内每条mRNA分子中约17bp的 标签片段进行测序和计数，从而反映相应mRNA分子表达水平． 评价两种技术平台在检测mRNA表达谱方面的特点，已成为关注热点．因此，本研究拟通过检 测和分析细胞mRNA表达谱，比较两种技术平台在差异基因检测能力、重复性、一致性以及检测动 态范围等方面的差异，为其它相关研究在技术平台选择上提供信息。 2材料和方法 2．1质粒构建和细胞转染 TOPO TA真核表达载体 我们将人DENND2D基因全长编码序列克隆入pcDNA3．1N5·His (Invitrogen,美国)，并经双向测序鉴定无误。随后将构建的表达质粒和空载体分别稳定转染入人非 小细胞肺癌细胞系NCI．H1299(以下分别简称为转染细胞和空载细胞)。 2．2RNA制备 并以ND．1000UV-VIS分光光度仪(NanoDrop 2100 RNA样本，其260／2801．9，完整性评分(ⅪN)9．0。 2．3基因芯片mRNA表达谱检测 HumanGenome 本研究选用的基因芯片为Agilent公司Whole Oligo 设计，即每张基因芯片分为完全相同且彼此分隔的4个区域，可同时检测4例样本。每个区域点制 有44k个探针，可完成对约4l，000个人类基因或转录本的检测。 我们用上述基因芯片，对转染细胞和空载细胞分别进行了4次重复检测。RNA样品标记、杂交、 芯片清洗和扫描以及数据后期处理的全过程，均按照基因芯片说明书，在北京协和医学院肿瘤医院 RNA 病因及癌变研究室实验室完成。样品采用Agilent公司低剂量RNA线性扩增试剂盒(LowInput Linear Kit Amplification FeatureExtracti