一种高效提取甘薯块根DNA方法.pdfVIP

352 中国杂粮研究 一种高效提取甘薯块根DNA的方法 阳义健1陈敏2杨春贤3张启堂4付玉凡4廖志华4 (1．西南师范大学生命科学学院：2．重庆市甘薯研究中心：3．生物技术研究所：4．天然产物与代谢工程实验室) 摘要：甘薯块根富含淀粉、多糖及酚类等次生代谢产物，这些物质严重干扰了DNA的提取。该 方法由传统CTAB法改进而来，通过提高抽提液试剂的浓度和增加纯化步骤等方法，有效去除 了淀粉、多糖及次生代谢产物的影响。使用该方法从3个品种甘薯块根中抽提到了高质量DNA。 在提取过程中，用氯仿／异戊醇代替酚，去除次生代谢产物等杂质，避免了残留酚对后续分子 生物学反应(如酶切、PER)的不利影响和危险试剂(如酚)的使用。使用该方法能在1d内提取 高质量的核酸，为进一步开展甘薯的分子生物学研究奠定了基础。 关键词：甘薯；块根：提取；DNA 总产量约1．5亿t，总产量和种植面积均居世界首位。甘薯具有很强的应用开发前景，目 前，国际马铃薯研究中心(tip)把选育高淀粉品种作为甘薯育种的主要目标之一；红心甘 薯富含B一胡萝卜素，可降低癌症特别是肺癌的发病率，又是维生素A原，也是一种天然色 素，在食品、医药、化妆品等领域得到广泛应用…；紫心甘薯品种富含花青素，而甘薯 花青素具有很强的抗氧化性和一些独特的保健功效，尤为人们所注目。 显然，传统的遗传育种很难适应形势的发展，而以甘薯作为生物反应器的分子生物学 研究势在必行。甘薯块根含有的大量淀粉、多糖、酚类化合物以及色素等次生代谢产物， 严重干扰了总DNA的提取旧1，其中，多糖在抽提过程中不易完全去除，在DNA沉淀过程中易 与DNA同时析出；酚类化合物使匀浆液呈褐色，产生褐化效应，其氧化产物能与DNA不可逆 结合，影响DNA质量口1。因此，用常规的DNA提取方法难以得到高质量的块根总DNA，影响 了对甘薯的分子生物学研究。目前，提取核酸的方法较多H~61，但由于上述原因，这些方 法都不能有效地从中得到高质量的DNA。本试验通过对传统CTAB法H1的改进，以3个甘薯品 种块根为材料抽提总DNA，取得良好的结果。 1材料与方法 1．1材料 试验用3个甘薯品种为通过国家审定或鉴定，并在生产上大面积推广应用的D19—2、渝 品种。这些品种均由重庆市甘薯研究中心保存、提供。 1．2主要试剂 DNA抽提液[3％CTAB(W／V)；100mmol／L Tris—HCl(pH8．0)；20mmol／LEDTA(pH8．0)： 1．4mo]／LNaCl；4％PVP(v／V)；4％13一巯基乙醇(v／v)]，TE溶液[10mol／LTris-HC]； lmol／L mol／L；用 冰乙酸调至pH值4．8～5．23。 1．3 DNA的提取及其分子生物学操作 1．3．1 薯类、，’j麟芝麻、綦挫 353 约1g{f辫块报于渣氯预冷的研钵th加入，“英砂}响女氮，縻成细微f粉木．逊遵将粉末 转入该jOml离心管，充分混匀，65=C水浴45m1 n’eI，逸轻霏鲡例潍匀3次。待冷却届加 用翦去尖端的15m1 riP头敢j．精_f二再F挣的{0ml离心管中，川氯仿／异戊醇(241．v／v) 重复抽提敬，取上清。醐八两倍体积～20C颁冷的无水已髀，轻轻藏倒混匀，宅温放置 5ml 15min垒白色絮状沉淀出现。州_翦盘，：端的1T】p头吸住絮状沉淀I；；j{，被八盛有1m175％ 己醇的l5ml离心管一f一，漂洗两次．啦十己薛，再用无水乙醇漂洗“次。将沉淀于室温f 500L 性至刚旧现牛遣叫状，f}J p TE溶解沉淀，可堋65C／K济助溶。待沉淀溶解届，加 入5HI lOmg／ml的RNaseA，涅匀．晡℃辩解40mi n。100009常温离心JOmin，取}清。 浦。_【{I氧仿／异戊