猪细小病毒非结构蛋白NS2和NS3基因的克隆和原核表达.pdfVIP

中国畜牧兽医学会畜牧兽医生物技术学分会暨中国免疫学会兽医免疫分会第九次学术研讨会论文集 猪细小病毒非结构蛋白NS2和NS3基因的 克隆与原核表达 王晓玲1,2，蔺文成1，胡峰1，王 朝1，刘朝霞1,2，周顺2，毕克东2，崔尚金P (1．中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室／猪传染病研究室，黑龙江哈尔滨150001； 2．青岛农业大学动物科技学院，山东青岛266109) mM、温度为37℃、诱导4h时表达量最大，分子量 SDS分析表明pET-NS2重组蛋白在IPTG浓度为1．2 为25 mM、温度为37℃、诱导4 ku；pET-NS3重组蛋白在IPTG浓度为1 h时表达量最大，融合蛋白的分子质量 为19．4l(u。对表达的可溶性蛋白，用钴柱亲和层析纯化得到了NS2、NS3的重组蛋白，westernblot鉴定表明， 重组蛋白具有反应原性。本研究为猪细小病毒的自然免疫、发病机制、病毒复制、免疫机理等研究工作奠定了基 础，未见以前有所报道。 关键词：猪细小病毒；NS2、NS3；原核表达 猪细小病毒(Porcineparvovims，PPV)是引起母猪 1材料和方法 繁殖障碍的主要病原之一，在世界各地广泛存在[1-21， 给养猪业带来巨大的经济损失。PPV是一种自主复 1．1 病毒株和质粒猪细小病毒BQ．C株【6】由本实 制型细小病毒，基因组为长约5．0kb的单链线状 验室分离、鉴定并保存。原核表达载体pET．30a(+) DNA分子，有两个开放阅读框(ORF)，编码有3种大肠杆菌感受态Rosetta、DH5a为本实验室保存。 1．2主要试剂PrimerSTARHSDNA 结构蛋白(VPl、VP2、vP3)和3种非结构蛋白 Polymerase、 (NSl、NS2、NS3)。PPV编码区基因相互重叠，dNTP、T4DNA连接酶、限制性内切酶XhoI、 BamH NS2基因重叠在NSI基因内，NS3基因重叠在NSI 和VPl内，VP2则重叠在VPl内【31。NS2含有161 限公司；质粒小提试剂盒和胶回收试剂盒为Axygen 个氨基酸，NS3含有106个氨基酸，二者N端的86 个氨基酸与NSl完全相同。因NS2和NS3基因是 不连续的，有独立启动子，在转录过程中，首先转 公司。HisPll—CobaltResin购自Thermo公司。 录形成前体mRNA，再切掉中间的间隔区形成成熟1。3引物根据GenBank上登录的PPV BQ—C株 的mRNA参与后期的翻译过程【矧。 5．0软件 目前还没有PPVNS2、NS3相关研究的报道，分析，设计引物(表1)，引物由哈尔滨博仕生物技术 本试验采用重叠延伸PCR方法对PPV基因组进行有限公司合成。 扩增，获得NS2、NS3的基因序列，构建NS2和 NS3的原核表达载体，获得重组蛋白。为下一步制 备NS2、NS3的抗体和进一步研究NS2、NS3蛋白 的的功能奠定基础。 作者简介：王晓玲(1984一)，女。山东烟台人，硕士研究生，主要从事猪病流行病学和防治研究 。通信作者：E-mail：cuishangjin@yahoo．cn。 ——99—- 中国畜牧兽医学会畜牧兽医生物技术学分会暨中国免疫学会兽医免疫分会第九次学术研讨会论文集 的3’端反向互补；P3中前21个碱基与NS2．1的3’10S；5