石斑鱼生殖生长相关基因的筛选和其表达特征分析.pdfVIP

石斑鱼生殖生长相关基因的筛选及其表达特征分析 周 莉，石耀华，姚波，夏伟，李创举，贾海波，桂建芳+ (中国科学院水生生物研究所，淡水生态与生物技术国家重点实验室， 武汉发育生物学中心，湖北武汉430072) 摘要本研究首先构建石斑鱼垂体和下丘脑的eDNA文库，筛选参与调控生殖生长与性腺分化相 关的功能基因，并研究其时空表达图谱。在从垂体和下丘脑SMARTeDNA质粒文库所筛选的267个克隆 中，共揭示出147个基因；除核糖体蛋白家族等管家基因外，还包括已知的8个与生长生殖调控相关的基 因和94个在GenBank中无同源性的基因。从147个基因中选取47个基因，设计针对各个基因的特异PCR 引物，采用RT—P(汛方法检测了它们的组织特异性、在性腺发育和胚胎发育过程中的时空表达图谱。根 据基因的组织特异性和性腺发育、胚胎发育过程中的时空表达图谱，从中选取了21个候选基因以进一步 研究其作用机理。本文主要报道在性腺发育不同阶段差异表达的GTH—a，TSH一0和两个新基因玎1和 rr2的时空表达图谱。 关键词石斑鱼；性反转；SMARTcDNA质粒文库；时空表达图谱；GTH—a；TSH—B；rrl；rr2 石斑鱼是一类名贵的海水鱼类，同时也是人工繁殖与育苗技术难度最大的海产鱼类之一。制约其人工规模化养殖的一 个关键因素是雄性亲鱼的培育。石斑鱼个体发育中普遍存在“先雌后雄”的性转变过程，雄亲鱼均高龄化【1-2】。前期的工作 主要集中在处于不同发育阶段性腺的组织学研究上【3-5]。最近，Lee等研究了石斑鱼性反转进程中内分泌的调控过程，结果 表明，在性反转不同发育进程中，有选择地激活特异的类固醇酶，从而合成调控石斑鱼性反转的各种代谢物【6-8】。 前期的研究表明通过埋植17a一甲基睾丸酮可以诱导斜带石斑鱼人工性反转，但产精极少或没有[9J。现在研究人员通 过体外测定人工性反转前后石斑鱼性腺中睾酮等激素的含量变化，以期了解性反转进程中的内分泌调控机制L6-sJ。然而，对 其性别决定分子机制的研究尚未见报道。因此，本研究首先构建石斑鱼垂体和下丘脑的eDNA文库，筛选参与调控生殖生长 与性腺分化相关的功能基因，并研究其时空表达图谱。 1材料与方法 1．1样品收集 将处于性腺分化前期、卵子发生期、变性期的斜带石斑鱼各一尾麻醉放血，分别采集肝脏、肾脏、脾脏、脂肪、心、肌、垂体、 下丘脑、端脑、小脑、中脑、延脑和性腺13种组织，以及未受精卵、处于桑椹期、高囊胚期、原肠中期、胚体期、视泡期、心脏分化 期、出膜前期的胚胎、出膜后和出膜后ld的鱼苗，保存于RNAIater(QIAGEN)@。 1．2 SMART cDNA质粒文库的构建 MechanismAt ofRNA 5’end eDNA 斜带石斑鱼垂体和下丘脑的SMART(Switching construction library Kit(clontech)操作手册改进的方法[10,11】合成。将石斑鱼垂体和下丘脑SMARTeDNA连接到pGEM—T载体 同源搜索。并根据所测序列，分别设计进行RT—PCR反应的上下游引物。 项目(KXCX2一SW一303) *通讯作者：Emaih jfgui@ihb．扯．∞ ·4· 第一届海洋生物高技术论坛论文集 1．3组织和胚胎总RNA的提取和RT—PCR反应 totalRNAisolation 9509和16009的赤点石斑鱼性腺的总RNA。总RNA的提取用SV 和质量。各取0．2t-tg的总RNA，用M—MLV逆转录酶(Gibco oj止矿物油。扩增产物经1％琼脂糖凝胶电泳分离。用鲫鱼的a— 释10倍后1／xL作模板。复性温度为60c|C，反应体系上覆1 2结果 2．1石斑鱼的垂体和下丘脑的SMART