利用转基因酵母筛选环境内分泌干扰物.pdfVIP

—— 笙二旦叁里墅望些兰兰查塑堕垒笙奎塞 利用转基因酵母筛选环境内分泌干扰物 张庆华1，K．-W,Schramm2(’中国科学院生态环境研究中心环境化学与生态毒理学实验宝，2871信箱， 北京100085， rceesac cn；2GSF．NationalResearchfor CenterEnvimnment Email：gbjiang@mail aIldHemth． Institute LandstraBe ofEcological Chemistry,IngolstadterI，D-85764 Neuherberg,Germany) 摘要：环境内分泌干扰物对环境健康的破坏正曰益受到国际社会的关注。有效的筛选方法是目前生态毒理 学研究的难点和热点之一，转基因酵母筛选法因其快速灵敏、廉价易行和高通量丽成为较为广泛应用的内 分泌干扰物筛选法之一。本文对传统的三角锥瓶摇动酵母暴露法进行了评价并与96孔培养板替代三角锥瓶 的改进进行了对比，获得了满意的效果。同时讨论了转基因酵母筛选法的缺陷。 关键词：酵母转基因内分泌干扰物雌激素孕激素 内分泌系统是人类和野生动物生长、发育、繁殖以及行为的最基本的调控系统，它通 过腺体及其分泌的激素来行使其功能。然而目前越来越多的研究表明，多种野生动物生殖力 衰退，野生群落退化，人类精子数量和质量降低、乳腺癌和睾丸癌发病率上升。这些不利影 响均与某些具有内分泌干扰作用的污染物在环境中长期低剂量存在有着密切关系。这类污染 物被统称为“内分泌干扰物”(Endocrine disrupter)Ill，它们能通过模拟或干扰内源性激素 的作用对人类和野生动物的健康产生各种负面影响。由于内分泌干扰物数量繁多，化学结构 之间并不一定有相同或相似的特征，所以单单依靠化学分析无法实现有效的鉴定。虽然现在 已经提出了一些生物筛选方法，但都存在较大的缺陷。目前美国国家环保局已将内分泌干扰 物各种评价模型的建立列为最优先资助的领域之--I”。 激素通过与受体基因或受体蛋白结合而产生相应的效应。根据这个原理，将相应受体 基因转入易于操作的酵母中并使其产生相应的响应，通过报导基因的表达就可以指示激素或 其它内分泌干扰物的作用。转基因酵母筛选法因其快速灵敏、廉价易行和高通量而成为较为 ，。泛应用的内分泌干扰物筛选法之一。图1是转人雌激素受体基因酵母筛选内分泌干扰物的 原理示意图。但是必须认识到与受体结合并不是内分泌干扰物作用的唯一途径【31。 目前利用转基因酵母筛选内分泌干扰物具体有两种操作方法【4j1。Gaido等介绍的方法 较为方便t但其采用的消化细胞壁的酶不易获得。Rehmarm等提供的方法材料易得，但需 要大量的三角锥瓶等，操作十分不方便。为此我们在Rehmann等使用的方法上进行了改进， 将暴露直接在微孔培养板上进行。选用了两种转人基因酵母，分别为转人雌激素受体基因 成功而需要重新构建，因而本文没有采用。 材料与方法 转人雌激素受体和孕激素受体基因酵母分别由D．Picardi”和K．wGaidot41赠送。三角 锥瓶(带一个凹槽，摇动时培养液会与槽相碰产生一定的振荡，利于酵母的生长。本文所提 三角锥瓶均指带一个凹槽的三角锥瓶)培养法具体的材料和方法请参见Rehmann等报导15】。 改进的培养板培养法采用96孔细胞培养扳。取暴露培养液20(I此移入培养孔中，放置在微 孔扳摇床上高频低幅地振动培养来代替三角锥瓶摇荡培养。OD600和OD。20的测定直接在酶 标仪上进行。其它操作与三角锥瓶摇荡法相同。 转人孕激素受体基因酵母培养法与转人雌激素受体基因酵母的培养法基本相似。区别 主要有：培养基中不用组氨酸和亮氨酸。添加色氨酸(8×10’g／mL)；暴露酵母oD600调整 至0．15；测OD。20时无需稀释。所有方法每个样品需平行三次以获得统计学上的可靠性。 ——箜二壁全里堡些些堂堂查塑堕垒堡塞篓 图1转人雌激素受体酵母中雌激素激活表达系统原理图(根据据Sumpter等【7】整理，反应底 物选用