葎草花粉cDNA表达文库的构建与初步鉴定.pdfVIP

萑草花粉cDNA表达文库的构建和初步鉴定 西安交通大学第二医院呼吸内科‘710004) 刘昀孙秀珍张王刚冯向莉 研究背景：草花粉致敏引起的I型变态反应病如过敏性哮喘等是影响全球健康的主要问题之一。应 用基因重组技术制备重组变应原疫苗应用于变态反应疾病的诊断和治疗，不仅可能提高诊断的特异性和 敏感性，而且还可能显著降低粗制变应原疫苗用于特异性免疫治疗(SIT)的副作用，成为国内外变态 反应领域研究的重要方向。国外目前很多花粉的cDNA文库已经构建，主要变应原成分及致敏蛋白组分 已经被克隆、分析，如桦树花粉、豚草花粉、杉树花粉、樱桃花粉等，既往研究发现萑草花粉是西北地 区最主要的气传致敏原之一。本课题主要目的是构建蓓草花粉eDNA表达文库，为筛选律草花粉主要变 应原阳性克隆及基因重组变应原疫苗的研制奠定基础。 方法于当年9月份蓓草花粉季节，选晴天在西安市郊区采集新鲜蓰草花粉，晾晒，9号分样筛过 滤后立即装入瓶中，投入液氮罐内。薇草花粉超声粉碎破壳，液氮研磨成组织匀浆，利用Tdzol法抽提 以CDSⅢ，3’ 验采用从总RNA中直接应用PCR方法合成eDNA第一链， 为模版，PCR扩增合成cDNA第一链(ss eDNA。蛋 为扩增引物，合成ds．cDNA，经20个循环后，1001xl中取5山经1．1％琼脂糖凝胶电泳检测ds 白酶K消化来灭活DNA聚合酶活性，然后蹄1消化加接头。将连接上的双链dseDNA经过凝胶柱层析， 收集大于400 构建cDNA表达文库。包装后噬菌体不同倍数稀释后感染宿主菌XLI．Blue，铺平板培养，蓝白斑筛选， 计算计算蓝白斑比例及噬菌斑数并计算噬菌体滴度及库容量，随机挑选单克隆噬斑体外切割后进行PeR 鉴定，推算出文库的重组率及插入片段大小。 结果 eDNA呈弥散分布(如图 (2)总RNA直接PCR反转录扩增合成dsDNA，经琼脂糖凝胶电泳检测，ds 2所示)，条带正常而且量足够。(3)测得的文库滴度为Ixl06Pfu／ml，文库体积500td，因此库容量为 Kb(如图 中在0．5N2Kb之间，经凝胶成像及分析系统(UVP公司)分析，平均插入片段长度约为1．02 3所示)。 结论所建文库容量及插入片段大小合适，适用于筛选目的cDNA克隆。本实验采用一种全新的 SMART技术构建eDNA表达文库，得到一个全长的高质量的eDNA表达文库。 草花粉致敏引起的I型变态反应病如过敏性哮喘、过敏性鼻炎、过敏性皮肤病等是影响全球健康的 主要问题之一．应用基因重组技术制备重组变应原疫苗应用于变态反应疾病的诊断和治疗，不仅可能提 高诊断的特异性和敏感性，而且还可能显著降低粗制变应原疫苗用于特异性免疫治疗(Srr)的副作用， 作者通讯地址：陕西省西安市西五路157#，西安交通大学第二医院呼吸内科710004 E-maih 电话：029 liuyunlll0@tom．com 成为国内外变态反应领域研究的重要方向。国外目前很多花粉的cDNA文库已经构建，主要变应原成分 及致敏蛋白组分已经被克隆，分析，如桦树花粉、豚草花粉、杉树花粉、樱桃花粉等，既往研究发现律 草花粉是西北地区最主要的气传致敏原之一。本课题主要目的是构建律草花粉eDNA表达文库，为筛选 蓰草花粉主要变应原阳性克隆及基因重组变应原疫苗的研制奠定基础。 材料和方法 1．1薇草花粉标本的采集 于当年9月份律草花粉季节，选晴天在西安市郊区采集j聿草花粉，晾晒，9号分样筛过滤后立即装 入瓶中，投入液氮罐内，一180℃冷冻保存。 1．2试剂 TRIZOL cDNA Construction Reagent购自Invitrogen公司，