麦胚凝集素的分离纯化与鉴定.pdfVIP

麦胚凝集素的分离纯化和鉴定 王凯南朱琳云曲爱琴李守玲 (山东大学生命科学学院生物技术系，山东济南250100) 摘 要：目的研究用鸡卵黏蛋白为配基亲和层析法分离纯化麦胚凝集素，并对纯化的 麦胚凝集素进行性质分析。方法先制备鸡卵黏蛋白的亲和层析剂，然后用其纯化麦 420Da， 胚凝集素。结果此亲和层析方法使麦胚凝集素纯化约l000倍，分子量20 p15．10。结论鸡卵黏蛋白亲和层析法是一种经济适用的纯化WGA的好方法。 关键词：麦胚凝集素：亲和层析；分离纯化；SDS—PAGE：等电聚焦 麦胚凝集素(wheat germ 与专一性糖结合，促进细胞凝集的二聚体蛋白质…，其优于一般凝集素的是可以和二糖 等以上寡糖基特异性结合，所以结合强度比较大口I。小麦胚芽中WGA的存在方式有水 溶性和与膜呈可逆结合状态两种。1962年，Aub等发现小麦脂酶抽提物中含有凝集 素，此后从麦胚酸性磷脂酶中也提取出了凝集素．直到1972年，Alien等才首次直接 从麦胚中分离提取了凝集素【3J。经过30多年来科学家们的不断努力，尤其是亲和层析 技术和晶体x．射线衍射技术的应用．在WGA的纯化技术、结构研究以及生理功能等 研究方面均取得了飞速的进展。 WGA可应用于细胞膜受体的分离研究，用于T淋巴细胞分离，纯化…，其具有 抑制真菌袍子萌发和生长的作用【5l，对艾氏腹水瘤细胞具有强烈的凝集能力，并能明显地 抑制其生长，能鉴别淋病双球菌和脑膜炎双球菌，对植物原生质体的凝集可用于细胞 融合实验16】等。WGA早期制备使用分级盐析法，后来采用纤维素离子交换法，近年 来分离纯化WGA。 1材料与方法 1．1材料 G．25(进口分装)；DEAE．纤维素(进口分装)； Sepharose一4B(进口分装)： r(进口)；Tri 心)：SDS(上海生物工程有限公司)；AC S(进口)；载体两性 电解质(进口)：宽域等电标准蛋白(进口)；其它试剂均为国产分析纯； 195 uVP凝胶成像仪(美国UVP公司)； 1．2方法 1．2．1WGA的分离纯化 1．2．1．1亲和吸附剂的制备17l 弃上清，沉淀抽气除丙酮后用15mLO．02mol／L pH6．5磷酸缓冲液溶解，过滤，滤液上 Sephadex 含0．3mol／LNaCl的0．02mol／L pH6．5磷酸缓冲液洗脱，并用Molish反应检测，收集第 三洗脱峰，对鸡卵黏蛋白液进行彻底透析。然后将鸡卵黏蛋白pH调至4．0，加3倍体 真空干燥，干燥后的鸡卵黏蛋白为透明胶状物。 NaCl和蒸馏水分别淋洗后抽干，加6．5ml 取89(湿重)Sepharose一4B用0．5mol／L 2mol／L NaOH、1．5mL环氧氯丙烷、15mL56％1，4．二氧六环，于40。C振荡2h。将活 pH9．5Na，CO，缓冲液洗 化的Sepharose一4B用蒸馏水洗去未反应残留试剂，用0．2mol／L 0．2 9．5 涤后抽干，再立即加入用20mLmol／L，pHNa，CO，缓冲液溶解的鸡卵黏蛋白， 40℃恒温摇床振荡24h左右，进行偶联。 1．2．1．2麦胚凝集素的提取 淀，调上清液pH至7．5，制得WGA粗提液，留取少量待测凝血活性。 1．2．1．3亲和层析分离纯化WGA 用0．5mol／LKCI一0．05mol／LCaCl一0．1m01／LTris．HCl pH7．8缓冲液平衡亲和层析柱(010 缩