两种特异性磷脂酶C对中华大蟾蜍发育后期尾部程序性细胞死亡调节的初步的研究.pdfVIP

两种特异性磷脂酶C对中华大蟾蜍发育后期尾部 程序性细胞死亡调节的初步研究 张尚立 苗俊英’ 万富刚 张华赵克温张捷 山东大学生命科学学院发育生物学研究所，济南250l∞，。联系人 【作者简介】张尚立1992年山东师范大学生物学系本科毕业，山东大学生命科学学 院工程师。主要从事发育过程中细胞分化和程序性细胞死亡方面的研究工作，研究 论文发表在《科学通报》和山东大学学报等刊物上。苗俊美，山东大学生命科学学 院教授。 【摘要】为了研究动物发育过程中程序性细胞死亡的分子机制，本文以两栖类的中 华大蟾蜍尾部变态为实验模型，利用尾部离体培养、组织化学和形态学分析等方法， 观察和分析了中华大蟾蜍变态过程中尾部程序性细胞死亡的形态学变化；同时比较 研究了磷脂酰肌醇特异性磷脂酶c(phospIla甜ylill∞i“一spec击cphospholipa∞C，PI— PM)和磷脂酰胆碱特异性磷脂酶c(ph∞phatidylcholiIle—specjficph08pholipB∞C，Pc— P比)的专一性抑制剂一化舍物48／80(Ⅻpolmd Ⅻtho目∞me)对蝌蚪尾部程序性死亡的影响。发现化合物48／80能显著促进中华大蟾 蜍变态中尾部的程序性细胞死亡，而D609对其有明显的抑制作用。表明该两种特异 性磷脂酶C在中华大蟾蜍尾部的程序性细胞死亡中发挥重要的调节作用。本文的 这一发现为深入研究发育过程中程序性细胞死亡的分子机制奠定了基础。 【关键词】发育，程序性细胞死亡，磷脂酶c，中华大蟾蜍 变态是研究动物胚胎发育后期基因表达和功能调控的理想模型，特别是两栖类的变态尤 为显著。几乎所有的器官都发生改变。蝌蚪的运动器官——尾部在变态过程中100％发生程 序性死亡，引起尾的消失。研究表明蝌蚪尾部程序性死亡严格受激素控制并与多种酶有关，但 是各种酶的作用以及程序性死亡的信号转导的分子机制尚不清楚。 最近已有充分实验证据表明化合物48／80能专一性地抑制磷脂酰肌醇特异性磷脂酶C，用 这种抑制剂发现该酶参与血管内皮细胞凋亡的信号转导。磷脂酰胆碱特异性磷脂酶c对细 胞凋亡的调控作用近几年倍受关注。在我们的先前研究中已初步证明该酶参与了中华大蟾蜍 蝌蚪尾部程序性死亡的调控过程。本研究利用这两种磷脂酶C的专一性抑制剂对其在中华 大蟾蜍蝌蚪尾部程序性死亡过程中的作用进行了比较研究。为深入研究发育后期程序性细胞 死亡的分子机制奠定基础。 一144— 一、材料和方法 取发育到27期的中华大蟾蜍蝌蚪。在无菌条件下剪取平均长度为10一的尾，放人含青 8alt 霉素和链霉素各100u，11ll的赫氏液(Holdk眦’880luⅡon)，在1℃±19的条件下培养24h，然 后将培养尾分成两组，每组3条，一组为对照，另一组加入15耐IId的化合物48，80，继续在无 菌条件下培养，每2d换一次培养液，每日测量尾长。取发育至36期的中华大蟾蜍蝌蚪，在无 菌条件下剪取平均长度为16—·的尾，用与上述相同的方法培养蝌蚪尾部，并在实验组培养液 d换一次培养液，每日测量尾 中加入20衅，Inl的D609(北京百灵威化学药物有限公司)，每2 长。 将处理到d7的尾用10％甲醛固定，观察尾鳍的变化，照相，然后进行石蜡包埋、切片和珊 染色。观察尾部组织细胞形态的变化。 实验重复3次，每次的每组取3条蝌蚪尾。用t分布进行数据处理和计算P值．以P 0．05为有明显差别，PO．01为有显著差异。 二、结果和讨论 1．PI一眦的专一性抑制剂化合物48，舯对蝌蚪尾部程序性细胞死亡的影响 围1离体培养的蝌蚪尾部(发育至打期)的长度变化殛其被化合物4s，帅促进的情况 ^一培养至d7的蝌蚪尾(对照组)；卜化台物48，町处理至d7的蝌蚪； C—A中的蝌蚪尾用10％甲醛固定；D—B中的斜蚪尾用10％甲醛固定 无尾两栖类发育后期的变态过程中尾部的消失是典型的程序性细胞死亡。发育的不同时 期尾部细胞死亡速度不同。以发育至27期的体外培养的中华大蟾蜍蝌蚪尾部(平均长