D-阿洛酮糖3-差向异构酶基因在枯草芽孢杆菌中的表达.pdfVIP

JIAMin。etal：ExpressionofD—Psicose3-EpimeraseinBacillussubtilis 受到越来越多研究者的注意。D一阿洛酮糖零能量 ， 其他常规试剂 ：进 口分装或 国产分析纯 ；引物合成 可预防肥胖l1；能降低血糖 ，可作为 II型糖尿病人 及 DNA测序 ：由上海生工生物工程有限公司完成 。 的辅助治疗剂 、膳食补充剂和甜味剂 ；可降低血脂 ， 质 粒 pET22b—cbdpe， 质 粒 pMA5， 宿 主 菌 减少脂肪合成酶活性 。抑制腹腔 内脂肪堆积阁；有抗 EscherichiacoliDH5c~和宿 主 菌 Bacillussubtilis 氧化活性 ，具有较强 的活性氧 (ROS)清除功能同；具 WB800：由作者所在实验室保藏。 有神经保护作用[71。鉴于D一阿洛酮糖 良好的理化性 1-2 培养基制备 质 ，美 国食品及药品管理局于 2011年对 D一阿洛酮 种子 (LB)培养基 (组分 L)：胰蛋 白胨 10．0，酵 糖的安全性进行确认 ，并正式批准其为GRAS(一般 母提取物 5．0，NaC110．0；pH7．0。 认为安全 ，GenerallyRecognizedasSafe)食 品，允许 发酵培养基 (组分 g／L)：酵母抽提物 15．0，葡萄 应用于食 品．膳食补充剂和医药制剂 中．具有巨大 糖 5．0，NaC18．0，MgSO4·7H2O 1．0，Na2HPO4·12H20 的市场前景8[1 1．0：自然 pH。灭菌后加人抗生素。 D一阿洛酮糖在 自然界 中存在极少 ，利用化学方 1．3 DPE基因的克隆 法合成 D一阿洛酮糖杂质多且不易分离。利用 D一阿 以大肠杆菌质粒 pET22b—cbdpe为模板 ，通过 洛酮糖 3一差 向异构酶 (D—psicose3一epimerase， PCR的方法进行 DPE基因扩增。为便于分离纯化 ， DPE，EC5．3．1．一)，通过催化 D一果糖 C3位的差 向异 设计 引物时将 pET22b质粒上带有 的His—tag标签 构化获得 D一阿洛酮糖 。作者所在实验室 已成功构 引入 目的基 因中，并在该基因的两端分别 引入两个 建大肠杆菌工程菌株 BL21(DE3)／pET22b—cbdte表 酶切位点，NdeI和 BamHI，设计一对引物如下 ： 达 DPE酶191但 由于大肠杆菌宿主安全性的问题 ，使 PMA1：5 一CGCCATATGAAATATGGTAT兀1ArT 其所表达 的DPE重组蛋 白不适宜应用于D一阿洛酮 TTGCT一3 糖 的T业化生产中。而枯草芽孢杆菌是食 品级微生 PMA2：5一CGCGGATCCITGTI1ACCCGCATCTC 物 ，属于GRAS级微生物 ，不存在 内毒素等食品安 一 3 全 问题 ，被广泛应用于各种工业酶制剂中[10-111。 PCR反应程序如下 ：94℃预变性 10min，94℃ 本研究 旨在利用食品级微生物枯草芽孢杆菌 变性 1min，56oC退火 1min．72℃延伸 lmin，35个 作为宿主菌 ，构建 DPE酶枯草芽孢杆基因工程菌 ， 循环 ．72℃延伸 10min，4。c保存 。PCR产物经 1．0 实现 DPE酶在枯草芽孢杆菌中的表达 ，为 D一阿洛 g／dL琼脂糖凝胶 回收预期大小 的片段。与 pMD—T一 酮糖的工业化生物酶法生产奠定理论基础。 19载体连接 ，转化大肠杆菌DH5c~感受态细胞 ，涂