新型马尔尼菲青霉菌Rho GTPase激活因子的RNAi研究.pdfVIP

第47卷 第5期 复旦 学 报 (自然科学版) Vo1．47No．5 2008年 10月 JournalofFudanUniversity(NaturalScience) Oct．2008 文章编号：0427—7104(2008)05—0593—05 新型马尔尼菲青霉菌 RhoGTPase 激活因子的RNAi研究 钮蓓蓓 ，陶菊红2，董 辉2，汤生荣2，任双喜2 (1．复旦大学 生命科学学院微生物学和微生物工程系，上海200433； 2．上海人类基因组研究中心，上海 200210) 摘 要：为探讨马尔尼菲青霉菌RhoGTPase激活因子基因的功能，构建 了以xylP为启动子，靶基因正反双向 序列被550bpgus序列隔开的干扰该基因表达的载体pCB309A-XRGT．利用根癌农杆菌的介导转化马尔尼菲青 霉菌，并以博莱霉素抗性筛选；实时定量PcR(Rea1一timequantitativePCR)检测发现该载体的干扰效率达83％， RhoGTPase激活因子基因的表达受干扰后 ，马尔尼菲青霉菌的菌丝生长受到抑制，菌落也较野生型及对照菌株 显著变小． 关键词：RNA干扰；马尔尼菲青霉；RhoGTPase激活因子；实时定量PCR 中图分类号：R397；Q949．327．1 文献标识码：A 马尔尼菲青霉菌(Penicilliummarneffei)属于腐物寄生菌，广泛分布于中国南部及东南亚地区，是 目 前已知300余种青霉菌中唯一具有温度敏感的两相致病菌 ]．在 25℃下培养呈丝状，无致病性，37℃下 培养则呈酵母状，有致病性．它能引起呼吸道、皮肤以及系统性霉菌病，特别是在免疫功能低下者和感染 HIV的患者中尤其明显_2’3J．随着艾滋病在全世界范围的蔓延，马尔尼菲青霉引起的急性系统性或播散性 感染明显增加l4j．为了解其致病机制，有必要开展与马尔尼菲青霉生长发育特别是与两态转变相关的基 因功能研究． 目前 ，国际上的相关研究均采用基于DNA同源重组原理的传统基因敲除方法[，引．然而，由于构建基 因敲除的载体繁琐，且在线性真菌中同源重组发生率低，因而限制了其在真菌基因功能研究中的应用 6． 而且对于某些必需基因，敲除后会引起细胞死亡，限制了研究的开展．因此，迫切需要建立一种快速、有效 的研究方法，以便进行大规模的基因功能研究． RNA干扰(RNAi)技术作为研究基因功能、表达调控及识别复杂信号调控通路的有效工具以及在疾 病基因治疗中的潜在应用价值，近年来一直是研究的热点[．与传统基因功能研究方法相比，此技术具有 操作简单、高效、特异性强等优点． RhoGTP酶(RhoGTPase)是细胞内一组关键性的信息传递体，已成为新的药物开发和治疗的靶分子 之一 J．研究表明，RhoGTPases可能对马尔尼菲青霉菌细胞极性生长发育有着极其重要的作用[51．此 外，前期研究中已建立了突变体库以及cDNA文库，大量基因的功能正等待我们去研究证实．因此，本研究 通过构建RhoGTPase激活因子的干扰载体，初步探讨马尔尼菲青霉菌RhoGTPase基因的功能． 1 材料与方法 1．1 材料 马尔尼菲青霉 PenicilliummarneffeiBO1由广西医科大学邓卓霖教授惠赠，质粒 pCAMBIA1304． 收稿 日期 ：2008—03—17 基金项 目：国家科技攻关计划资助项 目(2002BA711A16)和 国家高技术研究发展计划 “八六三 ”资助项 目 (2006AA02Z188) 作者简介：钮蓓蓓(1982一)，女，硕士研究生；通讯联系人 任双喜，男，研究员． 复旦 学 报 (自然科学版) 第47卷 pAN8一l，pDONYC，pCB309A和根癌农杆菌EHA105均为本实验室保存；质粒pXYLNOM 由澳大利亚墨 尔本大学的AlexAndrianopoulos教授惠赠．DNA限制性内切酶、T4DNA连接酶、r—Taq酶、4种dNTP、实 时定量PCR试剂盒等均购 自TaK水