02 实验二 蛋白质N端分析.pptVIP

DNS－Cl法测定胰岛素的N末端  DNS化反应 胰岛素 DNS-肽和DNS-蛋白质的水解 DNS-肽和 DNS-蛋白质在6.0 mol/L的盐酸中水解，释放出带有N末端标记的DNS-氨基酸。 聚酰胺薄膜层析 分离原理：各种被分离化合物在展层剂中的溶解度及其与聚酰胺形成氢键能力的大小的不同，决定它们在展层过程中迁移的速度差异。 Rf值-相对迁移率 Rf= AC／ AB A：样品起点 C：层析终止时样品 的色层 中心 B：溶剂前沿 展层及结果观察 展层剂： 甲酸（88%）：水 = 1.5 ：100（V/V） 1、展层10-15分钟，等溶剂前沿到达距薄膜顶 端1.0 cm 时，停止展层 2、标记溶剂前沿 3、干燥薄膜，在紫外线下观察结果 DNS-氨基酸双向展层 * * * 实验二 二甲氨基萘磺酰氯与氨基酸、肽和蛋白质N末端的氨基反应，分别生成有荧光标记的DNS-氨基酸、DNS-肽、 DNS-蛋白质。 灵敏度10-10摩尔。 DNS－Cl标记N末端氨基酸 聚酰胺：己二酸和己二胺的聚合物 nHOOC(CH2)4COOH + nH2N(CH2)6NH2 → -HN-CO-(CH2)4-CO-NH(CH2)6NH-CO- 分子中含有大量的酰胺基团 聚酰胺薄膜层析 聚酰胺薄膜：将聚酰胺均匀涂在涤纶基片上，干燥后制得的薄膜。 薄膜含有-CO-和-NH-基团，能与被分离的化合物形成氢键，可以分离酚类、酸类、醌类、硝基及胺基等化合物。 聚酰胺薄膜 B C2 A C1 1、加样（试管清洗干净！） 1号 0.2ml Phe ＋ 0.2ml DNS-Cl 2号 0.2ml Gly ＋ 0.2ml DNS-Cl 3号 0.2ml 胰岛素 ＋ 0.2ml DNS-Cl 2、薄膜封口，40oC反应20min 3、在电炉上将液体蒸干 4、在1、2号中各加入0.1ml 1.0mol/L HCl 制备DNS-氨基酸和DNS-胰岛素 微量加液器的使用方法 1、在3号管中加0.5mL 6.0mol/L HCl，封口 2、110oC水解12-18小时 3、在电炉上蒸发干液体 4、加入0.1mL 1.0mol/L HCl 老师准备！ 水解DNS－胰岛素 1、将1号和2号管中的液体分别转入0.5ml的 离心管中 2、加入等体积乙酸乙酯，萃取2分钟 DNS-氨基酸的萃取 点 样 注意： 1、用铅笔轻轻 标记点样点 2、点样点距薄 膜底端1.5cm 预期展层结果 展层起点 展层方向 1.5 cm 1 2 3 溶剂前沿