酶的定向进化.pptVIP

第八章 酶定向进化 二 突变基因的筛选 突变基因文库构建好以后，就可以根据定向进化目的的要求，在一定的环境条件下进行筛选，从突变基因文库中选取得到所需的突变基因。 在突变基因的筛选过程中，如果基因文库是以质粒载体构建的，在筛选时可以直接利用重组细胞在一定的环境条件下进行培养，从中筛选得到所需的突变基因；如果基因文库是以噬菌体DNA载体构建而成的，则首先要将重组噬菌体通过转导方法转入细胞，即让重组噬菌体感染受体细胞而获得重组细胞，然后再在一定的环境条件下进行培养，从中选取得到所需的突变基因。 （一）定向选择条件的设定 在基因突变的定向选择过程中，重组细胞培养的环境条件是根据定向进化的目的要求而人工设定的，所设环境条件需要在每一次突变—筛选的循环中得以调整，逐步向进化的方向靠近，最终达到目的，获得人们所需的具有新催化特性的进化酶。 根据酶本身的特性和进化目标不同，在突变基因的定向选择过程中环境条件的设定方式也有所不同，现举例如下: （1）如果定向进化的目的是为了提高酶的热稳定性，可以再较高的的温度条件下培养重组细胞，并咋一次突变—筛选的循环中逐步提高重组细胞的培养温度，经过几次循环以后，可以获得热稳定性较好的酶突变体。 （2）如果定向进化的目的是提高β－内酰胺酶的活性，从而提高对β－内酰胺酶类抗生素的耐受性，可以通过在含有一定浓度的β－内酰胺酶类抗生素的培养基中培养重组细胞，并在每一次突变－筛选循环中逐步提高抗生素的浓度。 （二）高通量筛选技术 通过体外随机突变形成了丰富多样的突变基因，构建的突变基因文库容量很大，而且这些突变基因大多数为负突变或中性突变基因，只有少数的正突变基因。要从突变基因文库中筛选的到人们所需的突变基因，筛选工作量很大，必须采用各种高通量的筛选技术才能达到目的 采用的高通量筛选技术要求通量大，效率高的特点，能够在较短的时间内简便的判断出那些是正突变基因，并容易排出那些无效的突变基因。 高通量筛选技术P217表8－2 一 平板筛选法 平板筛选法是将含有随机突变基因的重组细胞，涂布在平板培养基上，在一定的条件下培养，依据重组细胞的表型鉴定出有效突变基因的筛选方法。 平板筛选法所依据的重组细胞的表型包括细胞生长情况、颜色变化情况、透明圈情况。 （1）依据细胞生长情况筛选突变基因 在提高酶的热稳定性、抗生素耐受性、pH稳定性和对其他极端环境条件的耐受能力等方面有广泛应用。 2）依据颜色变化筛选突变基因 （1）在采用噬菌体DNA载体构建突变基因文库时，可以用大肠杆菌β－半乳糖苷酶的基因片断（lacZ′）插入到噬菌体DNA的间隔区域中，当它感染了相应的大肠杆菌宿主细胞时，在含有IPTG和底物X－gal的平板培养基上可以形成蓝色噬菌斑。 （2）在对磷酸酯酶进行定向进化的过程中，可以在平板培养基中加入硝基酚磷酸，接种重组细胞培养一段时间后，有些重组细胞周围出现黄色（硝基酚）。 3）依据透明圈情况筛选突变基因 依据透明圈情况筛选突变基因是在平板培养基中加入目的酶的作用底物，然后接种重组细胞，在一定条件下进行培养，培养一段时间后，在一些重组细胞的菌落周围会出现较大的透明圈。 二 荧光筛选法 荧光筛选法是通过观察荧光产生与否以及荧光的强度情况进行突变基因筛选的方法 是将具有荧光激发特性物质的基因作为报告基因，与突变基因一起克隆到载体中，形成重组细胞，在突变基因表达的同时报告基因也进行表达，由于报告基因的表达产物可以激发荧光，所以通过检测荧光的产生情况，就可以获得能够在重组细胞中表达的突变基因，从而将不能表达的无效基因排除 三 噬菌体表面展示法 噬菌体表面展示法是利用丝状噬菌体的外膜结构蛋白与某些特定的外源蛋白或多肽分子形成稳定的复合物，使目标外源蛋白或多肽富集在噬菌体表面的一种分子展示技术。 通过噬菌体表面展示法可以从突变基因文库中将能够表达出与噬菌体外膜蛋白相结合的蛋白质基因富集，筛选获得有效基因，排除大量的无效基因。 酵母细胞表面展示法 酵母细胞表面展示法是通过可以锚定在酵母细胞表面的特定蛋白（凝集素蛋白）与某些外源蛋白或多肽形成稳定的复合物，使这些外源蛋白或多肽富集在酵母细胞表面的一种分子展示法。 酵母细胞表面展示法主要有以下两种： （1）目的蛋白-a凝集素表面展示系统 （2）a凝集素-目的蛋白表面展示系统