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葡萄糖醛酸化功能模块的构建与应用 杨燕，王惠敏，王伟 ( 中国医学科学院、北京协和医学院药物研究所，天然药物活性物质与功能国家重点实验室， 卫生部天然药物生物合成重点实验室，北京 100050) 摘要：目的 构建葡萄糖醛酸化的功能模块，即在大肠杆菌体内构建活性糖醛酸 供体UDPGA 所需的三种功能蛋白和尿苷二磷酸葡萄糖醛酸转移酶(GAT)的功能 蛋白，以实现活细胞催化的黄酮的糖基化修饰。方法 优化大肠杆菌体内自身合 成尿苷二磷酸葡萄糖醛酸(UDPGA)的代谢途径，将从植物黄芩中克隆得到的糖基 转移酶基因(SbGAT-W76)转入到上述重组菌，得到4 种功能模块不同组合下的九 种工程菌。结果 确定了4 种功能模块都存在的工程菌株催化多种黄酮类化合物 的糖基化修饰，定向催化黄酮7 位的葡萄糖醛酸化。确定了催化体系为M9 培养 基(含2 % 葡萄糖) ，最佳体系为4 种模块都存在的体系。结论 本实验构建了黄 酮糖醛酸化反应的4 种功能模块，实现了活细胞催化黄酮的糖基化修饰，为此类 工程菌的应用提供了基础。 葡萄糖醛酸化是提高化合物水溶性的一种重要的修饰方法。而糖醛酸苷化的 黄酮是黄酮在人体代谢后的主要活性存在形式而天然较少。灯盏花乙素是葡萄糖 醛酸苷化的野黄芩素，是国内治疗脑血栓、冠心病及心绞痛等缺血性心脑血管疾 病的一线药物[1] 。但由于黄酮有多个酚羟基，糖醛酸苷合成步骤多，收率低。酶 法合成报道了黄芩UDP-葡萄糖醛酸转移酶，对黄酮7 位羟基邻位取代的黄酮具 有催化活性。 本文从中药黄芩（Scutellaria baicalensis Georgi. ）中克隆了UDP-葡萄糖醛酸 转移酶(SbGAT)，并在大肠杆菌中高表达合成活性糖基供体尿苷二磷酸葡萄糖醛 酸(UDPGA)的三个关键酶，获得糖醛酸化反应所需的4 种功能蛋白，将其不同组 合下的九种工程菌，探索其活性，最终得到可催化黄酮葡萄糖醛酸化的工程菌。 1 1 材料与方法 1.1 材料 1.1.1 菌种和质粒 重组的黄酮类化合物葡萄糖醛酸苷化的大肠杆菌工程菌株 SbGAT-W76，由本课题组构建；E. coli BL21 (DE3) 为本实验室保存。 1.1.2 试剂 标准品购自德国 sigma 公司；其他黄酮类化合物购自上海源叶生物 科技有限公司；其他化学试剂均为国产。 1.2 功能模块的构建和应用 1.2.1 黄芩 SbGAT-W76 基因的获得 黄芩无菌苗中提取总 RNA ，反转录获得 cDNA，以其为模板，PCR 扩增得到DNA 片段。纯克隆到EZ-T 载体上经测序验 证，获得编码黄芩的UDP-葡萄糖醛酸转移酶基因EZ-GAT 。 1.2.2 黄芩GAT-W76 基因与合成UDPGA 所需的三种蛋白的组合表达 将得到的 基因EZ-GAT 亚克隆到表达载体pTWINB ，得到表达载体pTWINB-GAT 。为实 现 GAT 与其它 3 个基因的共表达，把融合蛋白的阅读框亚克隆到以质粒 pACYC184 为克隆载体 [2] ，得到质粒 pACYC184-GAT ，将质粒 BL21(DE3)/pSLB208-PGM-GalU, pEG-UGDH 和pACYC184-GAT 共转化大肠杆 菌中。用终浓度0.55 mM IPTG 诱导剂在16℃低温诱导共表达。 1.2.3 工程菌体系的催化反应 反应在 100 mL 三角摇瓶中进行。收集已诱导表 达的工程菌，悬浮于M9 培养基中(含2 % 葡萄糖) ，调节菌密度值OD600 为3.0， 向该菌液中加入待葡萄糖醛酸苷化修饰的底物(0.6 mM)，置于摇床中(30 ℃，150 rpm)反应24 h 。 2 结果与分析 2.1 工程菌催化体系的优化 收集菌体悬浮于LB 培养基、LB 培养基(含2 %葡萄 糖) 、M9 培养基、M9 培养基(含0 %、1 %、2 % 、5 %葡萄糖) 。加入1.0 mM 的 底物黄芩素，反应6 h 。结果见图1。 由图1 可知，反应6 h 后，菌液的光密度有差异。表明LB 培养基体系更利 于菌的生长，但富含无