应用体内诱导抗原技术筛选I型鸭疫里默氏杆菌体内特异性表达基因.pdfVIP

第二届全国禽病分子生物技术青年学者论坛论文集 应用体内诱导抗原技术筛选I型鸭疫里默氏杆菌体内特异性表达 基因 袁建丰1，覃宗华，蔡建平，谢明权 (广东省农科院兽医研究所 广东省兽医公共卫生公共实验室，广州510640) IVIAT是利刚感染过目标病原的宿主血清来鉴定在宿生体内特异性表达的细菌毒力因子和抗原 基冈。其基本原理和技术步骤是采集已感染者的血清，以体外培养的病原菌吸附后，血清中存有针 对感染过程中特异性表达的抗原的抗体。以此抗体对病原菌的表达文库进行筛选，从而获得病原菌 vivoinduced 在体内诱导表达的毒力因子和抗原基因。奉研究的目的旨在利用体内诱导抗原技术(in antigen 达产物，为进一步确定RA的致病机理和解析保护性抗原组(repertoir)提供实验和理论经验。 1材料与方法 7日龄雏鸭攻毒后每日采集血清用ELSIA测定其血清效价，确定最佳康复鸭血清采集时间。康 复鸭血清经过与鸭疫里默氏杆菌和基因组表达文库宿主菌的全菌、超声裂解菌液以及热变性抗原的 方法构建基因组表达文库。利用吸附后的康复鸭血清骤对基因组表达文库进行免疫筛选(具体步骤 参考分子克隆)。重复筛选均为阳性的克隆送上海生工生物工程公司测序。序列相似性搜索分析采用 NCBI ORFFinder，ORFs 推导氨基酸序列比对采用NCBIPSI．BLAST，初步鉴定获得基因的功能． 2结果与讨论 为确定采集阳性血清的时间窗口，连续采集攻毒后12天的血清，ELISA检测结果表明抗体水平 在攻毒后第5d降至最低，随后缓慢升高，在12d达到最高。康复鸭血清经过RA和表达宿主菌的全 菌吸附、超声裂解菌液、吸附以及热变性抗原的吸附后，ELISA方法检测每个步骤的吸附效果，结 果显示吸附后的血清与菌体裂解抗原的反应明性显降低，达到了IVIAT文库血清的要求。对转化后 的基因组表达文库菌液进行倍比稀释铺板，37℃过夜培养 后，对生长的转化克隆进行计数，结果显示库容量约为10000个CFU。随机挑选的50个可能含有 重组质粒的菌落扩大培养后，PCR鉴定结果显示插入片段大小基本位于400．2000kb之间，且85％以 上分布在1000bp以．I-．。通过原位免疫印迹实验用吸附后的康复血清对RA基因组表达文库进行免疫 筛选，共筛选到阳性克隆23个，反复多次筛选后得到了12个强阳性克隆。对12个阳性克隆进行测 基冈相似性较高外，其余均无明显相似的序列存在，从而表明筛选获得的序列基本为新发现的RA 1本项H受广东省自然科学接金项H(060253W)资助 作者简介：袁建丰(1978--)，男．汉族。“：棼宜兴人t博士，丰要从事病原细菌学研究。E-maih 226 第三壁全望鱼堕坌兰兰竺垫查童±兰查笙堡丝查叁 一．一 ————————————————————————————————————————————————————一一 对20个ORF按功能可初步分为5类：2个信号途径基因，9个中间产物与能量代谢基因，5个细胞 膜相关基因，1个细胞分化基因，3个保守假想蛋白基因。 参考文献(略) 227