猪流行性乙型脑炎RT-LAMP方法的建立初步应用.pdfVIP

第八届会员代表大会暨第十五次学术研讨会论文集 计了6 条LAMP 引物，以保证反应的特异性。 本研究通过增加2 条环状引物，使LAMP 的反应时间缩短近一半，提高了检测效率。环状引物结 合的区域在F2-F1 或B2-B1 ，以Fl 到F2 的方向或是B1 到B2 的方向结合。当反应时，所有的茎环区 DNA 序列或与内引物杂交，或者与环状引物杂交，从而加快了反应速度。 LAMP 过程中能产生大量的靶DNA 和副产物—焦磷酸镁沉淀，只需用肉眼观察沉淀浊度即能判 断扩增与否。但当白色沉淀量少时，则难以判断[15] 。本文使用SYBR Green I 染料，不仅价格便宜， 易储存，而且染色后DNA 呈绿色，利于检测结果的观察。当出现阳性扩增时，橙色染料将变为绿色， 在紫外光照射下就能够判断。假如没有扩增反应，则原先的橙色染料不变，而且这种颜色变化非常持 久并能长期保存。LAMP 扩增产物在琼脂糖凝胶电泳图谱上呈阶梯状，是因为其扩增产物为茎环DN A 组成的混合物，即含有若若干倍茎长度的类似花椰菜结构的茎环DNA[16] 。 RT-LAMP 方法已经被应用于如西尼罗河病毒和CSFV 等人、动物和植物病原微生物的检测[17-18] 。 RT-LAMP 的推广使用，必将实现乙型脑炎病毒早期快速、准确、灵敏、特异、高通量、自动化检测和 鉴别诊断，不需要特殊仪器，大大提高乙脑病毒诊断的质量和效率，临床诊断多种病毒感染时，RT- PCR 将要代替传统PCR 和病毒培养方法，因为其具有高灵敏性和特异性，而RT-LAMP 又将替代其 他检测方法，在基层检验中广泛应用，将在 JE 的防制中发挥作用，同时可用来对样品中病毒的定性 检测。 参考文献（略） 猪流行性乙型脑炎RT-LAMP 方法的建立与初步应用 2，2 2 1 1* 1 2 2 1 1 1 1 1 卢冰霞 ，刘磊 ，秦毅斌 ，赵武 ，梁家幸 ，郭旋 ，黎木兰 ，李斌 ，何颖 ，苏乾莲 ，梁保忠 ，闭炳芬 ， 黄伟坚2* （1. 广西兽医研究所，南宁，530001 ；2. 广西大学动物科学技术学院，南宁，530005） 摘 要 【目的】建立一种快速、灵敏、特异的检测猪流行性乙型脑炎病毒（JEV ）逆转录环介导等温扩增（RT-LAMP ） 检测方法。【方法】根据JEV E 基因序列的保守区6 个位点设计了4 条特异性LAMP 引物，以JEV 阳性样品RNA 为 模板进行一步法扩增，并对反应条件和反应体系进行了优化。【结果】结果表明该方法具有较高的灵敏度，其检测极限 为0.5pg ；特异性实验证明其具有较高的特异性，对其他病毒性病原体均无扩增反应。与RT-Nested-PCR 比较，两种方 法检出率的符合率为 90.9%。而且反应结束后可以通过添加化学发光剂进行可视化观察，大大缩短了检测时间。该方 法无需特殊仪器，只需在水浴锅中进行，是一种适于基层的简便、灵敏、快速的猪JE 的检测方法。【结论】成功建立 了猪流行性乙型脑炎RT-LAMP 方法，并在临床上进行了初步的应用。 关键词 猪流行性乙型脑炎病毒；RT-LAMP ；敏感性；特异性 【研究意义】乙型脑炎病（Japanese encephalitis virus ，JEV ）毒属于黄病毒科中的黄病毒属，其 引起的日本乙型脑炎（Japanese encephalitis ）是一种以损害神经系统为主的急性传染病，会引起人类 急性病毒性脑炎，目前已在占人类1/2 人口居住的地区流行，其疫区已基本包括了亚洲大部分地区及 澳大利亚，并有不断扩大的趋势，且在同一地区存在不同毒株同时流行的情况[1] 。JEV 可以引起妊娠 母猪出现流产或产死胎、公猪睾丸炎和仔猪的脑炎等等，给养猪业带来巨大的损失。更为重要的是猪 可以作为JEV 的储存和增殖宿主，在传播媒介蚊的作用下，可以使JEV 在猪和人之间互相传播，JE V 不仅给养猪业带来巨大损失，而且JEV 在猪群中的流行也给人类的安全健康带来巨大的威胁[2] 。因 此，建立一种快速、方便、准确的RT-LAMP 方法来监测JEV 在猪群中的流行情况，具有重要的经济 价值和公共卫生学意义。随着科技的进步，广西养猪业的规模化养殖的不断扩大，生猪生产位居全国 第八，猪只饲养量大，更新加快，为JEV 的扩大传