氨基酸类物质紫外光谱分析.docVIP

氨基酸类物质的紫外光谱分析 一、实验目的1）掌握紫外–可见分光光度计的工作原理与基本操作。 学习紫外–可见吸收光谱的绘制及定量测定方法。 了解氨基酸类物质的紫外吸收光谱的特点。 二、实验原理 紫外-可见分光光度法属于吸收光谱法，分子中的电子总是处在某一种运动状态中，每一种状态都具有一定的能量，属于一定的能级。电子由于受到光、热、电等的激发，从一个能级转移到另一个能级，称为跃迁。当这些电子吸收了外来辐射的能量，就从一个能量较低的能级跃迁到另一个能量较高的能级。物质对不同波长的光线具有不同的吸收能力，如果改变通过某一吸收物质的入射光的波长，并纪录该物质在每一波长处的吸光度（A）,然后以波长为横坐标，以吸光度为纵坐标作图，这样得到的谱图为该物质的吸收光谱或吸收曲线。 当一定波长的光通过某物质的溶液时，入射光强度I0与透过光强度It之比的对数与该物质的浓度c及厚度b成正比。其数学表达式为： （一） 式（一）为Lambert-Beer定律，是分光光度法定量分析的基础，其中T为透光率(透射比）。 物质的吸收光谱反映了它在不同的光谱区域内吸收能力的分布情况，不同的物质，由于分子结构不同，吸收光谱也不同，可以从波形、波峰的强度、位置及其数目反映出来，因此，吸收光谱带有分子结构与组成的信息。 氨基酸类物质的一个重要光学性质是对光有吸收作用。20种氨基酸在可见光区域均无光吸收，在远紫外区（220 nm）均有光吸收，在紫外区（近紫外区）（220 nm—300 nm）只有三种AA有光吸收能力，这三种氨基酸分别是苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸，因为它们的结构均含有含有苯环共轭双键系统。苯丙氨酸最大吸收波长在259 nm、酪氨酸在278 nm、色氨酸在279 nm，蛋白质一般都含有这三种氨基酸残基，所以其最大光吸收在大约280 nm波长处，因此能利用分光光度法很方便的测定蛋白质的含量。 本实验将对苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸三种氨基酸进行光谱测定及相关定量测定。 三、仪器和试剂 1 仪器 紫外-可见-近红外分光光度计（UV-3600；分析天平； 0.5 mL、1.0 mL、2.0 mL移液管若干；10 mL带塞比色管若干。 2 试剂 标准溶液(a): g/L的氨酸溶液； 标准溶液(b)：0.4 g/L的氨酸溶液； 酪氨酸待测样。 四、实验步骤 1 分别移取标准溶液(a)（g/L， mL）和标准溶液()（g/L，0. mL）标准溶液于10 mL比色管中，用去离子水稀释、定容、摇匀，待用。 2 分别移取、、、 mL标准溶液（）于5个10 mL比色管中，并用去离子水稀释、定容，摇匀，待用。 3 双击分光光度计图标“UVProbe”,出现软件界面，点左下角“连接”，系统开始自检，等系统自检结束。预热15-30分钟。待仪器稳定后方可使用。 4 在光谱测量模式下，以去离子水为参比溶液，分别绘制步骤（1）中各溶液在200～350nm波长范围内的吸收光谱。并记录各标准溶液的λmax 。 5 在定量测定模式下，以去离子水为参比溶液，测定步骤（2）中的各标准溶液在λmax处的吸光度。 6 在步骤5同样条件下，测定未知样品溶液在λmax处的吸光度。 五、数据处理 1）将酪氨酸和色氨酸溶液的吸收光谱叠加在一个坐标系中，比较它们的吸收峰的变化，说说有什么不同，为什么？ 的最大吸收波长nm比苯长这是因为有一个吲哚基，有一个苯酚基，吲哚基的共轭体系要比苯酚基的大，因此色氨酸的最大吸收波长会比酪氨酸大。 （2）以上述步骤6测得的各标准酪氨酸溶液的吸光度为纵坐标，相应的浓度为横坐标绘制工作曲线，再根据未知溶液的吸光度，利用标准曲线求出待测样浓度。 由ORINGIN作图可知，标准曲线=0.220C+0.035 测得未知样的吸光度为通过标准其浓度为mg/L （由图可知标准差较大，可能是溶液配制时后两个样两次移取造成的移液误差） 六、思考题 1）本实验是采用紫外吸收光谱中最大吸收波长进行测定的，是否可以在波长较短的吸收峰下进行定量测定，为什么？ 不可以，通过谱图可以看到波长较短的吸收峰，无法确定其最大吸收处的波长，另一方面它可能是吸收叠加的结果，不适合进行测定。 被测物浓度过大或过小对测量有何影响？应如何调整？调整的依据是什么？ 浓度过大则有可能超出标准曲线的线性范围，导致测量不准确。浓度过小会比较大。所以调整被测物的浓度使它的吸光度落在标准曲线的中部，这样测量会比较 （3）思考紫外-可见分光光度法应用于蛋白质测量的依据，并设计相应的实验方案，测定奶粉中蛋白质的含量。 含有大量的氨基酸残基，如此大量的氨基酸中，经过统计平均氨基酸的含量应该大致相同，所以我们可以通过测定其中一种氨基酸然后用蛋白质的平均含氮量反推蛋白质质量。是一种浊液，其中的物质颗粒光的散射