氨基酸类物质的荧光光谱分析.docVIP

氨基酸类物质的荧光光谱分析一、实验目的 1）熟悉F-4600型荧光分光光度计的工作原理和定性测量方法。 掌握物质的最大激发波长和最大发射波长的测量方法。 学习识别荧光物质的分子荧光峰和拉曼散射峰。 二、实验原理 荧光物质分子吸收了特定频率辐射能量后，由基态跃迁至第一电子激发态（或更高激发态）的任一振动能级，在溶液中这种激发态分子与溶剂分子发生碰撞，以热的形式损失部分能量后，而回到第一电子激发态的最低振动能级（无辐射跃迁）。然后再以辐射形式去活化跃迁到电子基态的任一振动能级，便产生荧光。 荧光分析法具有灵敏度高、选择性好、工作曲线线性范围宽并能提供激发光谱、发射光谱、发光强度、发光寿命、量子产率、荧光偏振等诸多信息等优点，已成为一种重要的分析技术。但由于能够产生强荧光的物质相对较少，故其应用不太广泛。对于没有强荧光或没有荧光的物质的测定可设计相应的反应使其生成具有荧光特性的配合物进行测定。能产生强荧光的物质分子，一般都具有大的共轭π键结构或具有刚性平面结构等特征。 色氨酸（Try）、酪氨酸（Tyr）和苯丙氨酸（Phe）是天然氨基酸中仅有能发射荧光的组分，可以用荧光法测定。荧光分光光度计（如日本日立公司的F-4600）主要由光源、激发单色器、样品池、发射单色器、检测器及信号记录显示系统等所组成，其基本结构如下图所示： 荧光结构示意图 由光源发出的光经第一单色器（激发单色器）分光后入射到样品池上，产生的荧光经第二单色器（发射单色器）分光后进入检测器，检测器把荧光强度信号转化成电信号并经过放大器放大后经信号记录显示系统输出信号。通常在激发单色器与样品池之间及样品池与发射单色器之间还装有滤光片架，以便不同荧光测量时选择使用各种滤光片。滤光片的作用是为了消除或减小瑞利散射光及拉曼散射等的影响。仪器由计算机控制，并可进行固体物质的荧光测量及低温条件下的荧光测量等。 固定第二单色器的波长，使测定的荧光波长保持不变，而不断改变第一单色器的波长，测定相应的荧光强度，所得到的荧光强度与激发波长的谱图，称为激发光谱。 固定第一单色器的波长，使激发光的波长和强度保持不变，而不断改变荧光的测定波长（即发射波长），测定相应的荧光强度，所得到的荧光强度与发射波长的谱图称为发射光谱。 同一荧光物质的分子荧光光谱曲线的波长范围不因它的激发波长值的改变而位移。由于这一荧光特性，如果固定荧光最大发射波长，然后改变激发波长，从激发光谱中确定最大激发波长。反之，固定最大激发光波波长值，测定不同发射波长时的荧光强度，既得荧光发射光谱曲线和最大荧光发射波长值。由于不同的荧光物质有各自特定的荧光发射发射波长值，所以，可用它来鉴别各种不同的荧光物质。 三、仪器和试剂 1 F-4600型荧光分光光度计；四通石英比色皿一个；10 mL带塞比色管若干。 2 试剂 标准溶液(a)g/L的氨酸溶液； 标准溶液(b)：g/L的氨酸溶液； 四、实验步骤 1 配制实验样品 （1）分别移取标准溶液(a)（ mL）、标准溶液(b)（1 mL）和标准溶液(c)（0.4 mL）于10 mL比色管中，用去离子水稀释、定容、摇匀，待用。 （2）分别移取0.0、0.2、、、mL标准溶液（b）于个10 mL比色管中，并用去离子水稀释、定容，摇匀，待用。 2 仪器操作 （1）双击分光光度计图标“FL-Solutions”,等系统自检结束。预热15-30分钟。待仪器稳定后方可使用 （2）选择光谱测量界面（“Method”--“General”—“Measurement”—“Wavelength scan”），绘制上述步骤（1）中各溶液的激发光谱和发射光谱，并确定各自的λEmmax和λExmax。 （3）选择定量测定界面（“Method”--“General”--“Measurement”--“photometry”），依据上述步骤中测得的酪氨酸的λEmmax和λExmax，设定定量测定的参数，测定系列标准溶液的荧光强度Is值，然后在相同条件下测量未知样的相对荧光强度Ix，并记录实验数据。 五、数据处理 （1）将测得的氨酸、氨酸的激发光谱和发射光谱叠加在一个坐标系中，比较荧光峰位置及强度的变化，讨论各荧光峰变化的理论依据。 由图读出，两条曲线的峰值都大约在305，定位最大发射波长。测最大激发波长：波 由图可知酪氨酸的最大激发波长为225nm。 色氨酸：将激发波长依次设定为200、220、240nm，测得的色氨酸的发射波长信号强度 由图读出，酪氨酸的发射波长约为361nm，随着激发波长从240nm-200nm递减，信号强度不断增加，说明该波长减少过程中离色氨酸的激发波长越来越接近。 将探测的发射波长设定为361nm，测得色氨酸激发波长信号强度如下： 由图可知，色氨酸的最大激发波长约为291nm。