RNA的提取与cDNA合成与realtimePCR-100125.docVIP

RNA的提取，cDNA合成及realtime PCR 一：RNA提取 1．RNA提取中应该注意的事项 模板mRNA的质量直接影响到cDNA合成的效率。由于mRNA分子的结构特点,容易受RNA酶的攻击反应而降解,加上RNA酶极为稳定且广泛存在,因而在提取过程中要严格防止RNA酶的污染,并设法抑制其活性,这是本实验成败的关键。所有的组织中均存在RNA酶,人的皮肤、手指、试剂、容器等均可能被污染，因此全部实验过程中均需戴手套操作并经常更换（使用一次性手套）。所用的玻璃器皿需置于干燥烘箱中200℃烘烤2小时以上。凡是不能用高温烘烤的材料如塑料容器等皆可用0.1%的焦碳酸二乙酯(DEPC)水溶液处理,再用蒸馏水冲净。DEPC是RNA酶的化学修饰剂,它和RNA酶的活性基团组氨酸的咪唑环反应而抑制酶活性。DEPC与氨水溶液混合会产生致癌物,因而使用时需小心。 细胞内总RNA制备方法很多,如异硫氰酸胍热苯酚法等，许多公司有现成的总RNA提取试剂盒,可快速有效地提取到高质量的总RNA。本实验室采用Trizol?试剂进行总RNA的提取，纯化的mRNA在70%乙醇中-80℃可保存一年以上。 2．RNA提取所需要准备的试剂及器材 1）试剂 三氯甲烷、异丙醇、DEPC水（配制方法参考分子克隆）、75%乙醇（用经DEPC处理的去离子水配制） 2）设备及器材 真空泵、分光光度计、匀浆器（用于组织来源的样本）、冰浴、RNase-free的eppendorf管、RNase-free的枪头、一次性手套、一次性口罩、一次性帽子。 3．RNA提取的步骤 3．1 细胞在Trizol?试剂中的匀质化 此步骤因样本类型的不同在操作上略有不同，请操作者依据情况而定。 组织样本 　　将事先经180℃干烤过夜的匀浆器置于冰浴中，加入1ml Trizol?液，然后将新鲜取得的或保存于液氮中的组织块50-100mg（注意样品总体积不能超过所用Trizol体积的10%），经生理盐水清洗后迅速置于Trizol?液中，仔细研磨，直到形成均一的混合液，整个操作在冰上进行。 单层贴壁细胞 将培养皿中的细胞培养液吸干，直接在培养皿中加入适当体积的Trizol?液（1ml/10cm2），Trizol?液的不足会造成DNA的污染。用枪吸打混合液数次，直到形成均一的混合液，无粘稠现象。 悬浮细胞 首先通过离心收集细胞。用PBS清洗细胞两次，除去上清后加入适当体积的Trizol?液（1ml/5-10×106细胞）。用枪吸打混合液数次，直到形成均一的混合液，无粘稠现象。 注意：当样品中混有较多的蛋白、多糖、脂肪或者肌肉组织的时候，需要进行额外的一个分离步骤。在细胞与Trizol?充分混合均匀后，在2-8℃，12000g离心10min，抽取上清到一个新的EP管，以除去不溶性的物质。然后再新的EP管中进行以下步骤。 注：放在Trizol?中的RNA可放于-80℃冰箱中保存，长达半年。在样品数目较多，或者不同时间点收集的样品一时无法完成RNA提取的全部操作程序，可以考虑选择这样的方式保存。 3．2 氯仿（三氯甲烷）抽提 将上述获得的Trizol?混合液在室温放置5min，使核蛋白复合物充分解的离。按照200ul/1ml Trizol?的比例加入三氯甲烷，用力摇匀15-30s，室温静置2-3min。用不大于12000g的转速2-8℃离心15min。离心后，Trizol?混合液会分为三层：下层为粉红色的有机相，中间层为薄薄的白色物质，上层为清亮的水相，只含有RNA，大约占60%。 3．3 RNA沉淀 将水相小心的转移到一个新的EP管中（注意不要碰到中间相），如果要进行DNA和蛋白的分离可保存有机相（操作按照Trizol?说明书进行）。加入吸出的RNA水相等体积的异丙醇，均匀混合后，室温静置10min，然后用不大于12000g的转速2-8℃离心10min。 注：异丙醇按照1：1的量加入。异丙醇沉淀中含有较多的盐离子，沉淀后要用75%乙醇漂洗，见下。 3．4 RNA沉淀的漂洗 将上清部分去除，加入至少1ml的75%乙醇（用经DEPC处理的去离子水配制），用振荡器振荡使RNA沉淀重悬，使RNA沉淀得到充分漂洗。然后用不大于7500g的转速2-8℃离心5min。 3．5 RNA沉淀的溶解 去除上清，室温干燥5-10min，可用一次性手套盖住管口，以防RNA降解。另外注意不要使RNA沉淀过干，影响RNA的溶解。用适当体积的DEPC水溶解RNA 沉淀，可将EP管放到55℃水浴中促进RNA 的溶解。 注：根据RNA沉淀大小适量调整DEPC水的体积，使RNA浓度尽量一致。 3．6 RNA质量的检测及浓度测定。 电泳检测：用1%的琼脂糖电泳观察RNA质量。总RNA由rRNA，tRNA和mRNA组成，三者分别占总RNA的80%， 1