PCR技术(兼容1).ppt

目 录 PCR的概念 PCR技术的创建 PCR的原理 PCR的反应体系和方法 PCR的类型和应用 三篇重要论文 经典循环参数（500bp以内） 荧光定量PCR标记方法 内掺式染料 SYBR Green I 序列特异性探针 Taqman Molecular Beacons Dual Probes(FRET) 引物特异性探针 Amplifluor (Intergen) 5’ 3’ 5’ 3’ SG Excitation SG SG SG SG Emission SYBR-Green I 5’ 3’ 5’ 3’ SG SG SG SG SG Excitation Emission SYBR-Green I Taqman探针3′端Q荧光分子能够吸收5′端R荧光分子发出的荧光,因此,正常情况下该探针检测不到5′端荧光分子发出的荧光,只能检测到3′端荧光分子的荧光信号,但当溶液中有PCR 产物(模板) 时,探针与模板退火,即产生了适合于核酸外切酶活性的底物,从而激活Taq 酶的5′外切酶活性,将探针5′端连接的R荧光分子从探针上切割下来,破坏了两个荧光分子间的FRET ,从而发出荧光,切割的R荧光分子数与PCR 产物的数量成比例,因此,根据PCR 反应液的荧光强度即可计算出初始模板的数量 荧光能量传递技术(fluorescence resonance energy transfer , FRET) Oligo 1: Fluorescein Oligo 2: LC Red 640 Excitation Emission Transfer 荧光共振能量传递（FRET Probe） R Q 5’ 3’ 5’ 3’ 5’ 3’ 5’ 3’ Excitation R Q Q R Q R Excitation 双标记探针（Taqman Probe） R Q Excitation R Q Q R Excitation Emission 分子信标（Molecular Beacon Probe） 总体积 50-100 ?l Buffer 缓冲液 dNTP 原料 Primer 引物 DNA分子 模板 Taq酶 DNA聚合酶 1 反应体系 PCR技术的基本过程(1) 模板DNA dNTP 引物 Buffer 预变性 模板DNA dNTP 引物 Buffer TaqDNA聚合酶 94oC5’ 2 基本过程 PCR技术的基本过程(2) Taq 酶 模板DNA dNTP 引物 Buffer 循环仪 94℃ 55 ℃ 72 ℃ Taq 酶 模板DNA dNTP 引物 Buffer 72 ℃ 5～7 min 琼脂糖凝胶电泳 PCR技术的基本过程(3) 1）PCR反应成分 （1）模板 单、双链DNA均可。 不能混有蛋白酶、核酸酶、DNA聚合酶抑制剂、DNA结合蛋白类。 一般100ng DNA模板/100?L。 模板浓度过高会导致反应的非特异性增加。 3 PCR反应条件 （2）引物浓度 0.1-0.5 ?mol/L 浓度过高易导致模板与引物错配,反应特异性下降。 （3）Taq DNA聚合酶（thermus aquaticus) 0.5-2.5 U/50 ?l 酶量增加使反应特异性下降;酶量过少影响反应产量。 （4）dNTP dNTP浓度取决于扩增片段的长度 四种dNTP浓度应相等 浓度过高易产生错误碱基的掺入,浓度过低则降低反应产量 dNTP可与Mg2+结合,使游离的Mg2+浓度下降,影响DNA聚合酶的活性。 （5） Mg2+ Mg2+是DNA聚合酶的激活剂。 0.5mmol/L-2.5mmol/L反应体系。 Mg2+浓度过低会使Taq酶活性丧失、PCR产量下降； Mg2+过高影响反应特异性。 Mg2+可与负离子结合,所以反应体系中dNTP、EDTA等的浓度影响反应中游离的Mg2+浓度。 2）循环参数 变性 使双链DNA解链为单链 94oC 20-30秒 (2) 退火 温度由引物长度和GC含量决定。 增加温度能减少引物与模板的非特异性结合;降低温度可增加反应的灵