鼠疫F1蛋白原核分泌性表达和鉴定.pdfVIP

202 中国医药生物技术 2012 年 6 月第 7 卷第 3 期 Chin Med Biotechnol, June 2012, Vol. 7, No. 3 DOI:10.3969/cmba.j.issn.1673-713X.2012.03.008 ·论著· 鼠疫F1 蛋白原核分泌性表达及鉴定 魏东，王国治 【摘要】 重组表达质粒菌株，并诱导目的基因表达，通过层 目的 构建重组质粒，在大肠杆菌中表达鼠疫菌 F1 抗原。 析纯化，获得了鼠疫 F1 重组蛋白抗原，为新型鼠 方法 用 PCR 方法扩增出带有信号肽的 F1 基因，将其克 疫疫苗的研制奠定了基础。 隆到表达载体 pET30a(+) 上，转化大肠杆菌 BL21(DE3) ； 用 IPTG 诱导目的基因表达，层析方法纯化 F1 蛋白，测 1 材料与方法 定其分子量、等电点、N 末端氨基酸序列，用 Western blot 1.1 主要材料 法检测其抗原性。 1.1.1 菌种及质粒 大肠杆菌 DH5a 和 BL21 结果 根据双酶切和 DNA 测序结果显示，F1 基因成功连 (DE3)、质粒 pET-30a(+) 均由本室保存。 1.1.2 分子生物学试剂 内切酶 Nde I、EcoR I、 接到表达载体 pET30a(+) 中，F1 蛋白主要为分泌性可溶表 达。测定纯化后 F1 蛋白的相对分子量约为 15.6 kD，等电 T4 DNA 连接酶、Pyrobest DNA 聚合酶、DNA 凝 点为 4.15 ，N 末端氨基酸序列与理论序列一致。经 Western 胶回收试剂盒和质粒 DNA 小量纯化试剂盒均为 blot 鉴定，能被兔抗鼠疫菌 EV 株血清识别。 日本 TaKaRa 公司产品。 1.1.3 其他鼠疫专用试剂 鼠疫菌 DNA 模板及 结论 成功克隆并构建了 F1 蛋白分泌性原核表达系统，所 鼠疫诊断血清（批号 ）均由兰州生物制 表达的重组 F1 蛋白具有较好的抗原性，为新型鼠疫疫苗研 品研究所提供。 制提供基础。 1.2 方法 【关键词】 耶尔森菌，鼠疫； 克隆，分子； 基因 1.2.1 引物设计与合成 根据文献报道的序列 表达 （Gene-Bank ：X61996 ）用 Oligo6.0 软件设计引物。 中国医药生物技术, 2012, 7(3):202-205 F1 上游引物：5′ GGCGAGTCCATATGAAAAAAA TCAGTTCC 3′；F1 下游引物：5′ CCGGAATTCTT 鼠疫是由鼠疫耶尔森菌（Yersinia pestis）引起 ATTGGTTAGATACGGT 3′；下划线分别为 Nde I、 的烈性传染病。鼠疫菌被列为重要的生物战剂和生 EcoR I 酶切位点。引物由宝生物工程（大连）有限 物恐怖剂，一直受到高度重视。人类历史上曾有 公司合成。 3 次暴发流行，夺走数亿人