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微生物学实验报告——双歧杆菌的分离纯化 微生物学实验报告 乳酸菌分离纯化—— 双歧杆菌的分离纯化 2012/6/5 实验目的：从酸奶等富含乳酸菌的物质中分离到具 实验材料：蒙牛冠益乳（含bb-12 双歧杆菌），伊利 有活性的双歧杆菌并进行初步鉴定。 酸牛奶（ABLS 益生菌），佳宝、光明原味酸牛奶， 实验原理：双歧杆菌是动物体肠道内的正常优势生 双歧杆菌乳酸菌三联活菌片（含长型双歧杆菌 理细菌，革兰氏阳性，无芽孢，没有运动能力，最 Bifidobacterium longum ），枯草芽孢杆菌（Bacillus 适生长温度37℃~41℃，专性厌氧。双歧杆菌的细胞 subtilis） 呈现多样形态，有短杆较规则形、纤细杆状具有尖 实验方法： 细末端形、球形、长杆弯曲形、分枝或分叉形、棍 1.培养基 棒状或匙形。单个或链状、V 形、栅栏状排列，或聚 双歧杆菌琼脂培养基 【蛋白胨（鱼粉）10.0g ，牛肝 集成星状。双歧杆菌的菌落光滑、凸圆、边缘完整、 浸粉 5.0g ，牛肉膏3.0g ，酵母浸粉 5.0g ，胰蛋白胨 乳脂至白色、闪光并具有柔软的质地(7)。 8.0g ，可溶性淀粉0.5g ，磷酸氢二钾1.0g ，磷酸二氢 因为双歧杆菌是严格厌氧细菌，所以双歧杆菌 钾1.0g ，葡萄糖10.0g ，乳糖3.0g ，L-半胱氨酸0.5g ， 的培养条件必须无氧，且培养基要具有低氧化还原 琼脂15g ，吐温80 1g ，溶液A （FeSO ·7H O 0.2g ， 4 2 电势。培养双歧杆菌最常用的方法是亨盖特厌氧滚 MgSO ·7H O 4.0g ，MnSO ·4H O 0.135g ，NaCl 0.2g 4 2 4 2 管法(1, 5, 7) ，此外还有厌氧箱法，厌氧袋法和厌氧 于100ml 蒸馏水定容）10ml ，蒸馏水定容至1L】 罐法等。亨盖特厌氧滚管法是亨盖特（Hungate）于 枯草芽孢杆菌LB 琼脂培养基 【胰蛋白胨10g/L ，酵 1950年发展起来的一套严格厌氧微生物的培养技术， 母浸粉5g/L ，Nacl10g/L ，琼脂粉15g/L】 主要原理是利用铜柱氧化除氧的滚管分离纯化法。 2. 简易厌氧罐法 亨盖特厌氧滚管法的优点是可以实时检查培养物， 将双歧杆菌琼脂培养基倒入培养皿中，待培养基冷 无氧效果好且花费不高，但需要专门的仪器和技术 却后，先用接种环取LB 琼脂培养基上生长的枯草芽 性很强的操作。本实验采用的简易厌氧罐法是一种 孢杆菌菌落接种在培养皿一侧，再于另一侧划线接 操作简单且成本很低的方法，主要原理是利用焦性 种酸奶或三联活菌片的稀释液，按照每L 容积1.0g 没食子酸除去厌氧罐内的氧气。该方法的缺点是焦 焦性没食子酸、10%NaOH 溶液10ml 加入厌氧罐后， 性没食子酸与NaOH反应过程中会产生一定量的 立即以凡士林和胶带密封，置于 37℃恒温培养 2-3 NO ，可能不利于细菌的生长；此外，过量的NaOH 天。 会将厌氧罐中的CO 一起除掉，而CO 对多数厌氧菌 2 2 的生长有促进作用。另外，在同一个培养皿上接种 好氧细菌（如大肠杆菌和枯草杆菌）能加强除氧的 效果。 本实验所用的培养基参考了NPNL培养基(6)和 BS