04 电泳技术.ppt

* * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * 根据有无浓缩效应，分为连续系统和非连续系统。前者电泳体系中缓冲液pH值和凝胶浓度只有一个，带电颗粒在电场作用下依靠电荷和分子筛效应被分离。后者电泳体系中由于缓冲液离子成分、pH、凝胶浓度及电位梯度的不连续性，带电颗粒在电场中流动不仅有电荷效应、分子筛效应，还具有浓缩效应，因此分离条带的清晰度和分辨率均较前者为佳 非变性条件下的凝胶电泳使蛋白质依据其固有特性，如大小、形状和电荷等进行迁移，在对蛋白质的分子量影响最小时，可以对蛋白质的低聚物状态、构象改变、电荷变异以及影响构象或电荷的翻译后修饰的情况进行分析。 * * * * * * * * * 毛细管电泳仪 凝胶真空干胶器  用于电泳后凝胶的干燥 干燥时间：20-40min 凝胶成像分析系统  用于对各种凝胶和放射自显影胶片、印记杂交片的分析 * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * 浓缩胶的作用： 浓缩胶中的氯离子形成移动界面的先导边界，而电泳液（pH8.3）中的甘氨酸分子则组成尾随边界，在移动界面的两边界之间是电导较低而电位梯度较陡的区域, 它推动样品中的蛋白质前移，样品夹在前导和尾随离子界面之间，使样品浓缩，并在分离胶前沿积聚。 分离胶的作用：分子筛和电荷效应 在pH8.8分离胶中，甘氨酸离子化，迁移率超过蛋白质，穿过堆积的多肽并紧随氯离子之后泳动。SDS多肽复合物从电位梯度界面中解脱开来，在电位和pH值均匀的区段泳动，依MW大小得到分离。 Acr/Bis % 线性分离 范围 kDa 15 12 10 7.5 5 10-43 12-60 20-80 36-94 57-212 分离胶 (7-15%, pH8.8) 浓缩胶 (4-6%, pH6.8) 加样 加电场，样品浓缩在界面上 电泳结束 — + 封胶条 梳子 平，凹玻板 斜楔板 电泳槽 DYCZ-24D型垂直板电泳槽 聚丙烯酰胺凝胶的配制 贮液 分离胶（10%） 浓缩胶（5%） ddH2O 3.3 ml 2.77 ml 30% Acr/Bis 4.0 ml 0.83 ml 1.5M Tris pH8.8 2.5 ml / 0.5M Tris pH6.8 / 1.26 ml 10% SDS 100 ml 50 ml 10% APS 100 ml 50 ml TEMED 10 ml 10 ml Total volume 10ml 5ml 20-37℃ 30-45min 20-37℃ 20-30min 按表中的顺序加入各溶液 每加入一种溶液，立刻混匀 TEMED加入之后聚合反应开始，应立即混匀并灌胶 聚丙烯酰胺具有很强的神经毒性，应带手套操作！！ 配胶步骤 安装玻璃板并放置胶条 加少许水到凹槽内测试两层玻板间隙是否漏液 吸取少量水加到分离胶液面上 标记上下层胶的界面：梳子下0.5-1cm处 倾去覆盖液，用滤纸将残余液吸去，注意勿破坏凝胶面 配制浓缩胶溶液，加过TEMED后，立刻灌胶 室温放置30min 室温放置30-45min 将玻璃板固定到电泳架上（凹槽面朝外） 立刻插入梳子，平的一侧贴高玻板，注意避免气泡 配制分离胶溶液，加过TEMED后，立刻用移液枪吸取溶液沿凹槽加入间隙，直到液面抵达划线处 倾去水分 取下玻璃板并抽出胶条, 缓慢取出梳子 将电泳架放入电泳槽内，在内外槽 分别加入电泳缓冲液直至没过上样孔 上样：每个样品10ml，加入梳孔中 加上电泳槽盖，并连接电泳仪（注意正负极） 样品前沿（溴酚兰）进入分离胶后，调整电压为130V 溴酚兰抵达凝胶底部，关闭电源，并取出玻板 在玻板和凝胶间注入水，小心剥离凝胶，标记分离胶方向 考马斯亮蓝染色过夜、脱色2-3h，照相 在电压为80V的条件下开始电泳 电泳步骤 将带胶玻璃板再次固定到电泳架上（凹槽面朝内） 双垂直电泳槽 可用各种凝胶电泳，可同时做两块板 电泳印迹 电泳转移即电泳