高效表达型T克隆载体的构建和其特性.pdfVIP

生垦塞堕望堑堂垫堕堡!旦箜!≥鲞箜窆翅 ··-——1137·--—— 文章编号：1007—4287(2009)∞一1137—113 高效表达型T克隆载体的构建及其特性 卢银平’，祝建芳，刘朝，董继华 (华中科技大学同济医学院附属协和医院病毒研究室，湖北武汉430022) 摘要：目的研制高效表达型T载体用于基因的表达及蛋白功能分析。方法限制性内切酶EeoRV酶切真核表 达载体peDNA3，回收线性化质粒片段与三磷酸胸腺嘧啶脱氧核苷酸(dr口)70℃退火，构成T克隆载体并回收纯化。 将增强绿色荧光蛋白基因(EG即)和中国旱獭a干扰素基因(删A5)分别扩增后直接克隆到新构建的表达型T载体， 转化感受态细菌，挑选阳性菌并制备质粒瞬时转染真核细胞，荧光显微镜观察F_BFP的表达，病毒保护试验检测中国 旱獭a干扰素的生物学活性。结果成功构建了表达型T载体，外源基因F_EFP和删A5克隆进该载体后可以进行 高效表达，基因转染72h后，荧光显微镜观察到F_：GFP基因转染细胞荧光阳性率在∞％以上，荧光强度高；病毒保护试 验表明eMFNA5基因转染细胞培养上清干扰素效价达l：640。结论新构建的表达型T载体可用于基因的克隆之外， 还可以直接用于基因的高效表达及蛋白质功能分析。 关键词：表达型T载体；基因克隆；基因表达 中图分类号：Q785 文献标识码：A Q啪徼细胞蚰∞0failighlyettld蜘t既pr蜘l-vee蛔 w础· ／2J‰p垤，历肜．肠啦向曙，删2N20。耐以．(巩呻删of Medical ogy，Union ofro,增ji College，HuarlmngUniversity旷Science埘耐死咖蝴，‰4311022。‰) Hospital Tb a toclone Abs嘣：Objectivedevelop e伍ciem唰：唧i∞T-vectoralld仞甲r伪starget pcDNA3 highly gene．Methods of mth V，the3’te瑚1inalt11eli珊棚ized a rl蛐ictiolrl即卿EeoR 8ing,le —IaslIlids慨digested pl舶mi哪addeddE炳哆th州dine Chinese髓咖衄interferon (drIP)by彻malillgreaction．ETlh鲫ced即即fluorescentproteingene(EGFP)aIld alphgene intot}lisT-vee=torafter aIldeMFNA5 aIld cloned (eMFNA5)were geneamplification，F_BFPwelle删in‰cellsBill(cells， eMFNA5 and 唧蒯vely．R酏-11leexpressionvector枷constructed绷蒯屿．F_BFP T-veetor110t be to alsoto a couldu8e