基因表达转录分析中内参基因选择.pdfVIP

维普资讯 T~niquesandMethods囡 圜 P-I] …s WWW．pibb．ac．ca 基因表达转录分析中内参基因的选择枣 张艳君 ， 朱志峰 D 陆 融 ， 徐 琼D 石琳熙 简 序 刘俊燕 姚 智 D” (’天‘津医科大学免疫学教研室，天津 300070；天津医科大学生物化学教研室，天津 300070； 深圳康哲药业有限公司，深圳 518029) 摘要 目前基因表达的转录分析多采用单一看家基因作为 内参来校正 目标基因的表达量．实验中以人肝癌BEL-7402细胞为 研究对象，应用实时荧光定量PCR技术，观察了新型三肽化合物酪丝缬肽作用后RPL13A、UBC、EIF4A、B2M、GAPDH 和ACTB共 6个看家基因mRNA水平的表达情况．经过 geNorm程序统计学分析处理，结果表明，这 6个看家基因的表达存 在差异，确定了RPL13A、UBC 2个看家基因用于校正 目标基因的表达量．基因表达转录分析中内参基因选择的必要性在实 验中得以证明，更重要的是为各种实验因素影响下(尤其是新物质作用下)内参基因的选择介绍和提供了一种行之有效的方法． 关键词 内参基 因，geNorm程序 ，基 因表达 ，实时定量 PCR 学科分类号 R331 基因表达分析在生命科学的众多研究领域中变 具有显著的抑制作用6[1．为 了深入研究YSv 的作用 得 日趋重要，其研究的深入将为探索疾病相关基 机理，我们首先需要 明确 YSV对看家基因的影响 因、了解基 因表达调控 的复杂 网络 、解析生命奥 情况．本研究选择 RPL13A、UBC、EIF4A、B2M、 秘、最终为人类服务大有裨益．在转录水平进行基 GAPDH和 ACTB共 6个看家基 因，通过实时定量 因表达定量的方法，如实时定量 PCR、RNA印迹、 PCR技术对 YSV作用下 BEL一7402细胞 中各看家 核糖核酸酶保护分析、基因芯片等，在蛋 白质水平 基 因 的 转 录 水 平 进 行 检 测 ， 同 时 采 用 进行定量的方法如蛋白质 印迹等，都需要应用 内参 Vandesompele等4[】编写的geNorm程序对检测结果 基因对 目标基因表达量进行校正，以期获得真实可 进行统计学处理，分析哪些看家基因适于YSv对 靠的结果．看家基因有几百种 ，最常用 的为ACTB、 肿瘤基因表达水平影响的研究． GAPDH、18SrRNA、28SrI A，理想 的看家基 因 1 材料和方法 应在各种实验因素条件下，各种类型的组织或细胞 中均恒定表达 ”【．然而，大量的研究结果表 明，任 1．1 人肝癌 BEL-7402细胞培养和总RNA提取 何一种看家基因的所谓恒定表达都只是在一定类型 将人肝癌 BEL一7402细胞经 0．25％胰酶 一0．02％ 的细胞或实验因素作用下 “有范围”的恒定．在其 EDTA消化后，用含 l0％FBS的RPMI一1640完全 他类型的细胞中或实验因素作用下则是变化的，有 培养基调整成 5xl04个 ／ml的单细胞悬液，每瓶 时可 以是 十 几倍 、几 十倍 甚 至 是 上 百倍 的 4ml接种于 25cm 细胞培养瓶 中，37℃、5％CO2 差异 ．盲 目地使用一种看家基 因作为内参 ，一方 的细胞培养箱 中培养 24h后，实验组分别加入含 面可能使基因表达的微小差异难以发现 ，另一方面 可能引致错误甚至相反的结论 5】．本研究中的酪丝 缬肽(tyroservatide，YSV)是一种新三肽化合物，化 国家高技术研究发展计划(863)(2004AA2Z31