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数字PCR 在乳腺癌预防及诊断中的应用 乳腺癌是女性排名第一位的常见恶性肿瘤。2011 年美国 CA: A Cancer Journal for Clinicians 杂志公布的最新统计数据显示，美国2011 年预计将有超 [1] 过23 万女性罹患乳腺癌，占女性新发恶性肿瘤的 30% ， 。其中 15%-25%的 乳腺癌患者显示为HER-2 基因过表达[2] 。 HER-2/neu （又称c-erbB-2 ）基因为表皮生长因子受体家族成员之一，是一 种原癌基因，研究表明，HER-2/neu 基因扩增或过表达的乳腺癌患者易早期复 发且生存期缩短。检测 HER-2 基因是否高表达对于患者的预后判断、治疗方案 的选择具有重要意义, HER-2 是乳腺癌明确的预后指标和药物治疗效果的预测 [3] 指标 。 目前，《乳腺癌HER2 检测指南(2011 版)》仍推荐IHC 与FISH 和(或)CISH 相结合的检测策略。IHC 操作简便，实验成本低，但是其分析结果是主观的，可 变的，不同的抗体和不同的实验人员都可能引发结果的不确定性，检测结果受样 本要求及缺乏判断标准等；而CISH 在研究数据支持方面则远不如IHC 与FISH。 因此，以HER-2 位点特异性荧光原位杂交探针为基础的 FISH 方法仍被认为是 “金标准”来判断HER-2 在DNA 水平上的扩增结果，尤其对低度扩增的检测更为 重要。FISH 检测耗时长，操作步骤繁琐，实验结果的判读过分依赖于实验人员 [4,5] 的经验，而且临床研究中发现FISH 检测也存在一定的局限性 。 为了提高HER-2检测的精确性及检测通量，有很多实验室开始使用qPCR平 台进行HER-2定量分析及拷贝数变异分析，但是这种方式属于相对定量分析，精 确性有限，不能有效区分微小的基因表达变化和拷贝数变异，尤其是对于异质样 本来说更为困难[6,7,8] 。 商业化数字PCR平台的出现，为提高HER-2检测的准确性提供了很好的解决 方案。QX100微滴式数字PCR系统采用创新的微滴化技术，将含有DNA或RNA 的PCR反应体系分成约20,000个微滴。经PCR 扩增后，逐个对每个微反应进行 检测，有荧光信号的微滴判读为1，没有荧光信号的微滴判读为0 ，根据泊松分 布原理及阳性微滴的个数与比例即可得出靶分子的起始拷贝数或浓度[8,9,10] 。 密西西比大学医学中心和Bio-Rad Digital Biology Center 的科学家们发现使 用QX100 微滴式数字PCR 平台可以对HER-2 基因的表达水平及基因组拷贝数 变异进行精准的定量分析。图1 显示在使用新鲜冻存的样本为实验材料，对其 cDNA 进行2 倍浓度稀释后，以GAPDH 作为参照基因，对HER-2 基因的表达 水平进行分析。图中结果清晰显示使用双重体系检测的浓度梯度具有很好的线性 关系，而且使用GAPDH 校正后的基因比例一致性。同时，该文献还指出，使用 EEF2 作为内参基因，对相同的实验体系进行HER-2 基因表达分析获得了类似 [11] 的实验结果 。 图1. HER2 RNA 水平浓度检测的线性分析 样本为Origene 公司的新鲜冻存样本CR561507 cDNA2 倍浓度梯度稀释，使用双重反应体系，HER-2（FAM 标记，图中蓝色方块显示），GAPDH （VIC 标记，图中绿色方块显示）。经GAPDH 校正后的 HER2 浓度 显示为红褐色的圆圈。每个点的误差线标示95%的置信区间。[11] 更进一步地，针对临床样本 HER-2 基因拷贝数变异分析的研究中，不同的实验 室也得到了类似的实验结果。在针对39 例临床样本的ddPCR 分析中，ddPCR 结 果显示其中的10 例样本HER-2 基因组拷贝数大于4.4 ，显示为HER-2 阳性。剩余 29 例为HER-2 阴性，HER-2 基因组拷贝数为 1.6-3。这个结果与之前IHC 和FISH [5] 的结果完全一致 。 以上这些实验结果都表明，ddPCR 可