钙激活Cl-通道对哮喘气道上皮杯状细胞增生活性的促进作用.pdfVIP

·23· 壁缓缓加入2．5％戊二醛，固定2h，拨离细胞团块。组相反，NFA干预组的杯状细胞数量明显减少(No／ 常规脱水、包埋，制备超薄切片，电子染色，水洗，晾 干，电镜观察并照相。接种相同浓度的亲本细胞作对 三、相关性分析 照。 经Pearson直线相关性分析表明，在正常对照组、 六、MTr法检测细胞的增殖活性 哮喘组的肺组织mCLCA3mRNA水平与支气管上皮 96孔培养板中接种培养各组细胞，浓度均为2× 杯状细胞数量呈正相关(r分别是0．695和0．775，P 104／ml。干预组细胞分别加入终浓度为1001xmol／L分别是0．026和0．008)；与哮喘组相比，NFA干预组 的NFA、20 的mCLCA3mRNA水平、杯状细胞数量均有所下降， ixmoL／L的SB203580，作用48h后，去上 清，每孔加入MTT溶液200一，继续培养4h。去上清，但杯状细胞数量下降更为明显，两者之间未能表现出 每孔加入DMSO200ld。轻度震荡混匀后，用ELISA 小鼠的mCLCA3mRNA水平与支气管上皮杯状细胞 测定仪，测定490nto处光吸收A490nm值。每组重复 6次。 数量也呈现良好的正相关(r=0．910，P=0．000)。 七、流式细胞仪检测细胞周期 四、转染前后细胞超微结构变化的检测结果 各组细胞在培养48h后，用PBS洗2次，离心利用透射电子显微镜观察转染hCLCAl基因前 (8000rpm)5min，弃上清，加入lmLPBS混匀，再加入 后细胞超微结构的变化。对未转染NCI—H292细胞 2mL无水乙醇立即振荡混匀。固定后的细胞用DNA细胞的观察可见：胞体呈圆形或椭圆形；细胞核基本 —PrepReagent染色15—20min，用流式细胞仪进行 规则，核膜有凹陷；核仁清晰；核内可见常染色质；粗 细胞周期检测。 面内质网少见；细胞膜向外伸出丰富的微绒毛。有多 八、统计学处理 个泡状线粒体，分布于质膜边缘，但嵴少见。在转染 采用SPSS10．0软件。数据以x4-8表示。多样 细胞中可见：较多增生活跃的核分裂相，胞质内靠近 本间比较采用方差分析，两两样本间差异采用LSD— 外膜可见到较多半透明分泌颗粒；可见到同心板层状 t检验。相关性检验采用Pearson直线相关性分析。P排列的粗面内质网，其上附着花瓣状多聚核糖体；线 O．05为差异有统计学意义。 粒体呈短棒状，嵴与基粒丰富。 结果 五、细胞增殖活性的检测结果 一、肺组织中mCLCA3mRNA的表达水平 MTr检测结果显示(图1)，与C1组细胞相比， RT—PCR检测mCLCA3 mRNA水平的结果显 示，各组在591bp处均出现特异条带。但正常对照组 条带极弱，哮喘组和NFA干预组则具有较为明亮的 条带。测量各组条带的灰度比值显示，与正常对照组 的A490nm值相近。 (0．273±0．015)相比，哮喘组(0．4394-0．019。t= 六、细胞周期的检测结果 21．632，P=0．ooo)和NFA干预组(O．4184-0．277，t 细胞周期可分为间期和分裂期。流式细胞仪法 =14．620，P=0．000)的灰度比值均显著增加。与哮主要检测间期，即分别计数处于Gl期(DNA合成前 喘组相比，NFA干预组的灰度值降低，但未能达到显 著差异(t=1．947，P=0．067)。 胞的比例。检测结果显示(图2)，与Cl组相比，H1 二、支气管上皮杯状细胞的数量 组细胞的Gl期和G2期比例减少(P0．05)，S期则 气道上皮杯状细胞胞浆中的粘液颗粒