构建重组表达质粒pBV220／mhNT4和mhNT4在大肠杆菌中的表达.pdfVIP

构建重组表达质粒 pBV220 ／mhNT-4 及 mhNT-4 在大肠杆 菌中的表达 张 华1 1 2 赵家良 胡海涛 （1.中国医学科学院北京协和医院眼科，北京 100730 2.西安交通大学医学院神经生物学中心，西安 710061 ） 中文摘要：利用基因重组技术将 mhNT-4 亚克隆到表达载体 pBV220 ，构建重组表达质粒pBV220 ／mhNT-4 ， 诱导表达 mhNT-4 成熟蛋白，鉴定 mhNT-4 的生物活性。将经鉴定的pGEM-T Easy /mhNT-4 克隆用限制性 内切酶 EcoR I,BamH I 消化，琼脂糖凝胶电泳回收片断。酶切原核高表达载体 pBV220 ，用限制性内切酶 EcoR I,BamH I 消化，琼脂糖凝胶电泳回收线性化载体。用 T4 DNA 连接酶连结两个回收片断，构建重组 质粒 pBV220 ／mhNT-4 。限制性内切酶消化，琼脂糖凝胶电泳鉴定重组质粒。经鉴定的重组质粒 pBV220 ／mhNT-4 转染大肠杆菌 DH5 α，温度诱导表达mhNT-4 蛋白。SDS-聚丙烯酰胺(SDS)凝胶电泳技术 分离表达的 mhNT-4 蛋白。制备 8~9d 鸡胚，分离并培养背根神经节(DRG)细胞。分别加入回收的表达蛋白 和牛血清白蛋白，培养鸡胚背根神经节 DRG 细胞，检测 mhNT-4 生物活性。重组表达质粒 pBV220 ／mhNT-4 构建正确，表达框架未发生改变。成功诱导表达、分离了 mhNT-4 成熟蛋白。表达蛋白组可见大量神经突 起自神经节组织快周缘向四周呈放射状长出，对照组未见神经突起长出。mhNT-4 成熟蛋白具有良好的生物 活性。本研究为进一步开展 mhNT-4 基因治疗青光眼提供了资料。 关键词： 人神经营养素-4 成熟蛋白基因（mhNT-4 ）；基因重组；表达载体；生物活性 青光眼是一种严重的致盲性眼病，是一组与视野缺损有关的具有特征性视神经病变的眼 部疾病，以高眼压为危险因素之一。青光眼的视神经病变和视野缺损，与视网膜神经节细胞 及其轴突在视网膜和视神经缺损相关，阐明视网膜神经节细胞死亡过程中的细胞分子变化是 目前一个活跃的研究领域，正被广泛应用于视网膜神经节细胞衰亡的机制研究中，并将为青 光眼治疗带来新方法。 神经营养素家族（neurotrophin family ）是神经营养因子中一组形态和结构密切相关的蛋 [1]，包括神经生长因子（NGF ），脑源性神经营养因子（BDNF ），神经营养因子-3 （NT-3 ）， 白质 [2-6] 。对脊椎动物神经元的存活具有 神经营养因子-4/5 （NT-4/5 ）和神经营养因子-6 （NT-6 ） 促进作用[7] 。目前，神经营养素家族已经成为神经系统研究的热点之一。 在以前的研究中，我们课题组已成功地从中国人白细胞中克隆NT-4 全长基因[8]和成熟 蛋白基因[9] 。本文从中国人白细胞中成功地克隆人神经营养素-4 成熟蛋白基因（the matured human neurotrophin-4 ，mhNT-4 ）并成功构建重组了真核表达质粒pBV220/ mhNT-4 ，为今后 [7，10-11] 研究在原核细胞中的表达，进一步开展青光眼基因治疗创造有利条件 。 1 材料和方法 1.1 载体与菌株 噬菌体载体pGEM-T Easy (50ng/μl), 购自Promega公司。重组质粒pGEM-T Easy/ mhNT-4，由作者构建成功[9] 。原核高表达质粒pBV220，见图 1；宿主菌E coli DH5α 由西安华广生物工程公司馈赠。 基金项目：首都医学发展科研基金资助项目（2002-1014），美国中华医学基金会资助项目