基于多肽微阵列芯片的荧光和共振光散射法筛选凝血酶抑制剂.pdfVIP

第43卷 分析化学 (FENXI HUAXUE) 研究报告 第2期 2015年2月 ChineseJournal of Analytical Chemistry 199~206 DOI:10.11895/j.issn.0253-3820.140532 基于多肽微阵列芯片的荧光和 共振光散射法筛选凝血酶抑制剂 1,2 *1 1 *1 苏敏 李 桃 刘殿骏 王振新 1(中国科学院长春应用化学研究所,电分析化学国家重点实验室,长春 130022) 2(中国科学院大学,北京 100049) 摘 要 研制了一种基于多肽微阵列芯片的荧光和共振光散射双通路检测方法,对血液样品中的凝血酶抑 制剂进行检测。 以生物素化的多肽微阵列芯片为反应平台,加入凝血酶水解多肽上的特异位点使其 C末端 的生物素解离,通过亲和素和生物素之间的特异性结合,用荧光探针和30 nm金纳米粒子探针标记此反应过 程。 凝血酶抑制剂阻止凝血酶对底物多肽的水解反应,通过荧光和共振光散射信号强度的变化检测抑制剂的 抑制能力。 酶溶液和加标人血清中测定的半抑制浓度(IC )值:阿加曲班抗凝血酶Ⅲ4-(2-氨乙基)苯磺酰 50 氟盐酸盐,IC 差的绝对值随抑制剂特异性的减弱而增大。 当抑制剂浓度为7.5 μmol/ L时,血浆中5种化合 50 物的抑制能力:阿加曲班抗凝血酶Ⅲ胰蛋白酶抑制剂N-(反式-环氧丁二酰基)-L-亮氨酸-4-胍基丁基酰胺 4-(2-氨乙基)苯磺酰氟盐酸盐。 在血浆中考察了阿加曲班和抗凝血酶Ⅲ的可逆性。 对比荧光法和共振光散 射法在血液样品中的检测结果,用30 nm金纳米粒子标记的共振光散射法更适用于复杂血液样品中抑制剂的 检测 关键词 多肽微阵列;金纳米粒子探针;共振光散射;半抑制浓度;凝血酶抑制剂 1 引 言 蛋白酶是水解蛋白质肽键的一类酶的总称,凝血酶是一种重要的蛋白酶,主要参与血液凝结级联反 [1] [2] 应,使血液凝结成块阻止血液流失 。 凝血酶与血栓栓塞性疾病的诊断和治疗密切相关 ,以凝血酶 [3] 为靶点的抗凝血药物是临床用于治疗血栓的主要药物 ,开发高效、价格低廉的抗凝血药物是目前药 [4,5] 物学研究热点 。 微阵列生物芯片技术可以在一张芯片上集成多种生物化学反应,能够实现对生物活性物质高效快 [6,7] 速地测试和分析 。 固定蛋白酶或蛋白酶特异底物的微阵列芯片可以同时分析多种抑制剂与蛋白酶 [8,9] 之间的作用机理和作用效率 。 Uttamchandani等用蛋白微阵列芯片同时检测了3种化合物对4 种半 [10] 胱氨酸蛋白酶的抑制效率 ;Neumann 等用小分子微阵列芯片从近 10 万个有机小分子中筛选出了 [11] 6种能与凝血酶活性位点结合的化合物 。 迄今为止,仍鲜有使用多肽微阵列芯片在血液样品中