表达T%2bPm保护性抗原重组猪霍乱沙门氏菌C500株构建及其生物学特性.pdfVIP

细菌病一猪其他细菌病 过卡那霉素抗件实验，表明含自．pBS—OSK质粒的大肠杆菌具仃Kan抗性；蔗糖敏感性实验表明含有 pBS．OSK载体的人肠杆菌对蔗糖敏感。本试验表明成功构建了以苦那霉素抗性基因(Kan。)和枯草芽 胞杆菌的果聚蔗糖酶基冈(sacB)的正负舣向筛选系统。 1．2重组转移载体pBoSKAIC的构建 以APP5 转移载体的左、右同源臂，将扩增到的片段TA克隆至pMDl9一T，经PCR、酶切和测序糁定正确后， 的ApxIC基因的APP5K17株最组转移载体pBOSK△IC。 2 APP ApxIC基因缺失突变株的构建 3h后将细菌均匀涂布在含卡那霉素TSA甲板培养18h，从平板卜筛选具有卡那霰素抗性的菌落，再 将}￡有K邱霉素抗性菌落接种到lO％蔗糖的TSA平板峪定射蔗糖的敏感性，在证实酶落Kan抗性、 蔗糖敏感的菌做PcR鉴定。随机挑选一株鉴定正确的菌落接种于无l那露素的TSB培养摹培养过 夜，以促进第二次同源重组，把培养物稀释后涂布含10％蔗糖小含卡那霉素的TSA琼脂平板，将筛 鉴定，最终筛选到一株豁定止确的AxpIC摹因缺失突变株(K17△IC)。遗传稳定性试验证实突变株 在体外连续传10代基冈能够稳定遗传。溶血活性试验证实突变株体外培养不表现溶血活性：细胞毒 性试验证实突变株的细胞毒减弱；缺失株的LD5t)为1．12×109，亲本株LD50为6．09×107。这些表明构 建的基凶缺失减毒株毒力明显降低，为进一步以此突变株作为摹凶上程弱毒活疫苗株的研究奠定了 一·定的基础。 表达T+Pm保护性抗原的重组猪霍乱沙门氏菌C500株的 构建及其生物学特性 赵战勤王臣 丁轲张春杰李银聚刘一尘 吴庭才程相朝 (河南科技大学动物科技学院动物病原微生物学实验室洛阳471003) 摘要粘膜免疫与多价疫苗是未来免疫预防传染病的重要方向，以细菌为载体的重组活疫苗是其最有发展前景的 multocida 研究领域之一。本研究利用Asd+平衡致死系统构建表达巴氏杆菌毒素(Pasteurellatoxin，PMT)的重组猪霍 乱沙门氏菌株，并对重组菌株的生物学特性进行比较研究。通过基因克隆的方法构建表达PMT的重组质粒 糖醇和尿素作为唯一碳源，但能利用一些其他糖类作为唯一碳源，这些生化指标与亲木菌株C500相同。同时发现 能够稳定遗传重组质粒及其外源基因片段，并能稳定，高效、分泌性表达30．5kDa的外源保护性抗原rPmtc。通过 生物学软件Bio．Rad 3．3％。其中，在菌体中的表达量约占总表达量的69．6％，分泌到上清液中的表达量(分泌性表达)占31．4％。 CFU，毒力稍低于C500(LD50为4．4x106CFU)：口服 C50l(pYA．PmtC)腹腔感染BALB，c小鼠的LD50为8．5x106 伤寒的双价基因工程覆苗奠定基础。 关键词猪霍乱沙门氏菌c500株；产毒巴氏杆菌；Asd+平衡致死系统；重组疫苗 基金项目：国家自然科学基金项目；河南科技大学科研创新能力培育基金项目(2009Czool0) 作者简介：赵战勤(1980．)，男，讲师，博士，主要从事细菌分子生物学及其基因工程疫苗研究。E．mail zhaozhanqin@L26．com 570 第四次猪病学术研讨会会议论文集 粘膜免疫与多价疫苗是未来免疫预防传染病的重要方向，以细菌为载体的重组活疫苗足其最有 发展前景的研究领域之一。近年来，以减毒沙rJ氏菌作为活疫苗表达载体的研究受到广泛关注。沙 『J氏菌为胞内寄生莳，疫苗株能有效旱递抗原，在激发抗沙门氏菌免疫反应的同时诱导产生针对外 源抗原的特异性体液和细胞免疫，以减毒沙门氏菌作为粘膜免疫用基因T程活疫苗载体具有无可比 拟的优越性。以前，人们普遍采用携带抗性基冈的表达质粒作为重组菌在体内牛长的丰要遗传选择 标记。近年来，出于生物安全性的考虑，抗牛素等抗性质粒选择系统已不被人们所接受。目前，已 经研制出多种策略替代抗牛素等抗性标记来控制外源基因的稳定表达。Asd+甲衡致死系统由沙门氏 菌的船磋凶缺失株与能表达二氨基庚二酸(DL．a，￡．DiaminopimelicacidDAP)的Asd+质粒构成。