SS2溶菌酶释放蛋白(MRP)B细胞表位预测、原核表达及免疫学特性的研究.pdfVIP

第四届中国兽药大会——兽医微生物学、兽医生物制品学学术论坛论文集(2012年) 吴立志1,2伍晓雄2，张松林1，刘磊1，肖跃强1，夏小静1，沈志强1+ 1山东省滨州畜牧兽医研究院，山东滨州256600；2华中农业大学动物医学院，湖北武汉430070 (方法)运 摘要： (目的)预测猪链球菌2型(SS2)溶菌酶释放蛋白(MRP)的B细胞表位，并分析其免疫学特性。 用ANTHEPROT5．0综合分析二级结构、亲水性、表面可及性与抗原性指数，预测MRP的B细胞优势表位簇；PCR扩增出表达 用重组蛋白免疫血清和灭活SS2免疫血清Westernblot检测重组蛋白的免疫原性及其与SS2免疫血清的反应性；纯化的重组 0～ blot显示预测的95 蛋白免疫雌性SPF昆明小鼠，SS2攻毒受试动物评估重组蛋白对小鼠的免疫保护力。(结果)Western 率为菌体免疫所提供保护率的66。7％。(结论)本研究为利用该细胞表位簇作为高效免疫制剂奠定了基础。 关键词：猪链球菌2型； 溶茵酶释放蛋白； B细胞表位；原核表达；免疫保护 SS2是重要的人畜共患病病原，可以导致人的脑膜炎、心内膜炎及中毒性休克综合症等疾患，严重影响 人身体健康；感染SS2的猪只发生脑膜炎、关节炎、败血症、浆膜炎、多发性关节炎等，对养猪业危害严 protein，MRP)、胞外蛋白因子 重n一1。SS2的毒力因子包括溶菌酶释放蛋白(Muramidase-released factor (extracellularprotein，EF)、溶血素(suilysin，Sly)、荚膜多糖(capsular 等口书3。MRP是存在于菌体胞壁的保护性抗原，在国内致病性SS2中均有很高的检出率，且不同菌株之间该 ku，难以大量获得全长原核表达的重组蛋白。本实验运 蛋白氨基酸序列高度保守口1。MRP分子量约为136 用生物信息学方法进行分析，预测了MRP的优势B细胞表位簇，运用分子克隆方法构建原核表达载体，以 期获得对小鼠具有一定保护力的基因重组工程蛋白。 1材料与方法 1．1 coliDH5Q、Ecoil 主要实验材料SS2标准株HA9801、E I和HindlI、T4DNA连接酶、 菌体小鼠高免血清、重组蛋白高免血清均由本研究室保存；限制性内切酶Xhoi TaqDNA聚合酶、DNAMarker、质粒小量抽提试剂盒、胶回收小量试剂盒均购于宝生物工程(大连)有限公 鼠购自山东省实验动物中心。 1．2序列分析与B细胞表位预测参考NCBI 信息查询号为CAM35504．1。通过编码核苷酸序列可查询该序列是否含有大肠杆菌表达的稀有密码子，在基 因克隆过程中需要将稀有密码子的碱基对突变；通过氨基酸序列与蛋白质序列数据库已有结构域序列的比 对可以预测该蛋白的特定结构域以及蛋白在细胞上的定位，选取表达的肽片段时，避开蛋白的毒力结构域、 5．0Ⅲ。对蛋 舍弃信号肽段、去除膜锚定结构域和处于膜内(胞浆)的肽段；运用蛋白分析软件ANTHEPROT 白的二级结构(螺旋、折叠、转角、无规卷曲)和B细胞表位进行预测(亲水性、疏水性、抗原性、可溶 性、跨膜结构、抗原可及性)综合分析，选出合适的肽段。 1．3 MRP一卜F：5’一CCGCTCGAGCGGAGGTTTTGCAGGAGTTTC一3’，下划线为XholI酶切位点。根据文献中Ⅲ1的方法 作者简介：吴立志(1986年一)，男，安徽池州人，硕士，主要从事动物生理生化与分子免疫学研究，E—maihwulizhi564@126．com． +通讯作者：沈志强，E—mail：bzshenz