均相LanthaScreen细胞分析一种常见GPCR传感器ERK1,2自动均相磷酸化检测.pdfVIP

A p p l i c a t i o n N o t e 药 物 筛 选 一种常见的 GPCR 传感器 -ERK1/2 的自动均相磷酸化检测 - 均相 LanthaScreen® 细胞分析 Paul Held and Peter Banks, BioTek Instruments, Inc. Winooski, VT Kristin Huwiler, Matthew Robers, and Bonnie Hanson, Life Technologies, Madison, WI 关键词：GPCR, LanthaScreen, ERK ，TR-FRET GPCRs 的激活会刺激活化各种信号通路，大部分信号通路的 MAPK/ERK 通路也可以被 GPCR 的激动剂所激活。这些机 激活均可能导致细胞外调节蛋白激酶 1/2(ERK1/2) 的磷酸化。 制涉及到第二信使依赖的蛋白激酶，β-Actin 的富集，或受 因此，针对 ERK1/2 的磷酸化检测可以代替 GPCRs 的活性 体酪氨酸激酶的转录激活。ERK1/2 的磷酸化激活可以做为 G 检测。本文介绍了一种将 BacMam 调节的 GFP-ERK2 传感 蛋白依赖及 G 蛋白不依赖的标记信号。然而，直到目前为止， 器基因传递技术和 LanthaScreen® 细胞学实验技术相结合的 一直缺少可以高通量检测 ERK 活性的技术。我们推出了一种 时间分辨荧光共振能量转移技术（TR-FRET ），该技术用来 BacMam ERK1/2 细胞学分析方法，该方法将 BacMam 介导 检测 ERK2 细胞外的磷酸化水平。上述技术的结合使检测任 的 GFP-ERK2 传感器基因传递分析法和 LanthaScreen® 细胞 何感兴趣细胞的 GPCRs 活性变的更为灵活和可行。本文所 学实验技术结合起，来检测胞外的 ERK1/2 的磷酸化水平。 介绍的是一种均相的，可以和自动化技术整合的实验方法。 BacMam 病毒是一种被修饰的杆状病毒载体。杆状病毒是一 种昆虫细胞病毒，对哺乳动物细胞没有毒害，而且不会在哺 介绍 乳动物细胞内进行复制。该病毒载体包含一个 CMV 表达调控 G 蛋白偶联受体超家族作为药物靶点成员代表着现代医学的 元件，可以维持约 5 天高水平的瞬时表达。此外，该病毒可 核心，大部分畅销药和约 40% 处方药都是以其作为药靶。受 以允许大片段的插入 ( 达 38kb) ，并转染到原代细胞株和干细 体酪氨酸激酶细胞膜受体 (RTK) 和 G 蛋白偶联受体 (GPCR) 胞株。( 图 2) 通过几种不同的信号通路调节从细胞膜到细胞核的胞外信号。 信号被传递，根据信号强度和持续时间不同诱导出不同的细 胞反应。细胞外调节蛋白激酶 (ERK) 介导细胞表面受体通过 不同的信号通路传递细胞增殖及分化的信号，被视为是一个 关键的调节因子。( 图 1) 图 2 BacMam 病毒 BacMam ERK1/2 细 胞 实 验 使 用 BacMam ERK2 病 毒 转 染 干细胞，导致了 GFP-ERK2 融合蛋白的表达。( 图 3A) 当表 图 1 GPCR 介导的 MAPK/ERK1/2 活化。 达 GFP-ERK2 细胞受到刺激，ERK 被磷酸化，细胞开