胶质细胞源性神经营养因子基因转导成肌细胞和其表达.pdfVIP

胶质细胞源性神经营养因子基因转导成肌细胞及其 表达 1 1 2 2 1 李权 ，冯扬 ，唐休发 ，华成舸 ，何等旗 1 四川大学口腔疾病研究国家重点实验室，成都（610041 ） 2 四川大学华西口腔医院口腔颌面外科，成都（610041 ） E-mail: liquan100@163.com 摘 要：目的 探讨转导GDNF 基因后，成肌细胞生长情况及GDNF mRNA 表达情况 方 法 采用胰酶胶原酶分步消化法、差速贴壁提取 SD 大鼠原代成肌细胞，并纯化、鉴定、扩 增。然后以AD-GDNF 转导成肌细胞，用MTT 检测转导后细胞生长情况；通过观察绿色荧 光蛋白的表达，来观测转导效果；以RT-PCR 法检测转导的成肌细胞中GDNF 基因 mRNA 的表达情况。结果 转导48h 后，在荧光显微镜下观察到较强的荧光表达。通过RT-PCR 检 测，可见在转导组位于对应DNAmarker600bp 处产生一条特亮条带，与预期的GDNF 的PCR 产物片段大小相符合，而未转导组则见一低亮度条带。说明Ad-GDNF 转导成肌细胞后能够 获得GDNF mRNA 的高表达。结论 GDNF 基因转染入成肌细胞后不会影响成肌细胞的正 常生长，GDNF 基因能够在成肌细胞中高表达。 关键词：胶质细胞源性神经营养因子；成肌细胞；基因转导；腺病毒；骨骼肌组织工程 中图分类号：R331 1. 引言 胶质细胞源性神经营养因子（GDNF ）最先是由Lin 等在 1993 年从大鼠胶质细胞来源 的B49 细胞株的无血清培养基中分离出来的[1]。最初发现GDNF 对多巴胺能神经元有高特 异性营养作用[2,3]。进一步研究认为 GDNF 是一种多效能营养因子，对多种神经元有促存 活及损伤保护作用，且是迄今发现的神经营养因子中作用最强的[4,5,6]。因此我们考虑将 GDNF 基因转入成肌细胞中，以期在组织工程化骨骼肌组织植入体内的早期发挥促神经生成 的作用。本实验以成肌细胞作为靶细胞，利用腺病毒介导 GDNF 基因转导成肌细胞，并探 讨GDNF 对成肌细胞生长的影响，以及转导后GDNF 的表达情况。为骨骼肌组织工程神经 化的进一步动物体内实验奠定基础。 2. 材料与方法 2.1 材料 新生3 天的SD 雄性乳鼠（购自四川大学实验动物中心），F-12 培养基（Gibco,Invitrogen ）, DMEM 培养基（Gibco ）,I 型胶原酶（Invitrogen ）,胰蛋白酶（Gibco,Invitrogen ），青霉素（华 北制药），链霉素（华北制药），新生小牛血清（Hyclone Culf ,Perbio Science Company ）,兔 抗鼠结蛋白单克隆抗体（北京中杉生物公司），Envision 复合物（北京中杉生物公司），5%CO2 培养箱（美国Forma Scientific 公司），高速离心机（日本Ssnyo 公司），IX70 型倒置相差荧 光显微镜（日本OLYMPUS 公司）引物探针（上海生物工程有限公司），Trizol （美国MRC 公司），TaqDNA 聚合酶（TAKARA 公司），dNTP （TAKARA 公司），Marker （北京天为时 代） 2.2 Ad-GDNF 来源 Ad-GDNF 由四川大学华西医院眼疾病分子遗传实验室提供[7]。Ad-GDNF 携带有大鼠 - 1 - 全长的GDNF cDNA 。 2.3 成肌细胞的分离、培养与鉴定 取新生3 天SD 雄性乳鼠的四肢肌肉，PBS 液洗涤3 次后置于双抗（青霉素：链霉素为 1：1）中，用眼科剪将其剪成1mm3 大小，再用PBS 液洗涤3 次。然后加入足量1：1 混合 的0.1%胶原酶I 和0.25%胰蛋白酶，37℃水浴振