铜绿假单胞菌实时荧光PCR检测方法建立应用.pdfVIP

201l食品安全技术与标准国际研讨会暨AOAC中国区会议论文集 铜绿假单胞菌实时荧光PCR检测方法的建立与应用 尹伟力，方绍庆，耿金培，刘宁 (1．烟台出入境检验检疫局山东烟台264000) 表明，对比现有的检测方法，以ETA基因为靶基因，基于TaqMan探针的快速FQ．PCR检测技术有更高的灵敏度和 更好的特异性等优点，具有很好的应用前景。 关键词：铜绿假单胞菌；外毒素A；荧光定量PCR,TaqMan探针；检测 铜绿假单胞菌(Pseudomonas 见的获得性致病菌。铜绿假单胞菌在机体免疫力低下时可引起多种疾病。临床上主要引起人皮肤化脓感染， 特别是烧伤、烫伤、眼部疾病患者被感染后，常使病情恶化，并可引起败血症。还可引起呼吸道感染、心内 膜炎、尿路感染、中枢神经系统感染、骨关节感染、眼科、耳、乳突及鼻窦感染、消化道感染等。目前PA的 临床分离率已居医院感染监测细菌的首位【】2J，有较高的死亡率。国家质量监督检验检疫总局、卫生部等部门 有明确规定，在食品、化妆品、外用药品以及絮用纤维制品等物品中不得检出铜绿假单胞菌。PA快速的定性、 定量诊断有利于及时、有效地控制PA感染，因此对PA检测方法的研究具有重要意义。 铜绿假单胞菌常规诊断方法包括细菌培养检测法和免疫学检测法。但以上传统的检测方法实验步骤多、 周期长，不能满足临床诊断的要求。目前，常规PCR法检测PA的研究已有报道，但该方法需要对PCR反应进 一对特异性引物和一个TaqMan探针，建立PA的实时荧光PCR检测方法。 1．材料和方法 1．1试验用菌 PA2株标准菌株：购自中国普通微生物菌种保藏管理中心。金黄色葡萄球菌、副溶血弧菌、沙门氏菌等 20株阴性对照菌株：分别购自深圳太太基因工程有限公司。 1．2试剂 购自上海生物工程有限公司。 1．3引物、探针的设计与合成 Express 淬灭基团。引物和探针由上海生工生物工程技术有限公司合成。 —·374-— 201l食品安全技术与标准国际研讨会暨AOAC中国区会议论文集 表I引物和探针的序列 !!!!：!蔓竖!型l璺!堇暨竺121宝：21巴尘笠苎型￡罂!￡空!垒￡三墨 Name ％GCTmvalue Sequence Length／bp 1．4ETA标准质粒的构建 1．4．1细菌的培养 培养48小时。 1．4．2 DNA模板的制备 mixture 物对PA 20mmol／L)2．5山，dNTP ETA基因进行PCR扩增。扩增体系25I．tl，含10xTaq缓冲液(MgS04 lIll，Pf及Pr引物(30pmol／L)各O．121．tl，Taq 72℃延伸5min。 1．4．3 ETA质粒的构建 Vector上并转化到E．coli 以胶回收试剂盒回收、纯化ETA扩增片段。将纯化后的片段克隆到pUCm-T 菌株的序列完全一致。用分光光度计测定pUCm．T．ETA浓度与纯度，-20℃保存。 1．5FQ．PCR反应体系的建立 unlol／L6--1．2 递增，引物浓度从1umol／L～2umol／L递增，探针浓度从0．5 反应体系，并优化循环条件。 1．6FQ．PCR定量标准曲线的建立 并将标准质粒lO倍梯度稀释4个梯度，利用优化好的FQ．PCR反应体系检测4个反应管的循环域值，建立 质粒拷