体内化学交联与质谱分析法证实蛋白质相互作用.docVIP

体内化学交联和质谱分析法证实蛋白质相互作用 蛋白复合体的分离可用不同的亲和色谱法。在经典的免疫亲和实验中，细胞裂解液中的蛋白复合体能被固定化了的抗体获取，该抗体识别复合体中已知成分的抗原决定簇。经过多次洗涤以去除非特异性结合蛋白，该复合体由质谱法分析（MS）。短暂性结合复合体，其解离常数高，不适合这种方法。本文通过一种新的方法，用体内化学交联和基于鉴定蛋白质的质谱分析法来鉴定瞬时作用的蛋白复合体。活细胞用甲醛处理，其快速蔓延到细胞膜，形成蛋白质-蛋白质化学交联。互作蛋白质交联到一个含有Myc标签的蛋白质上，通过免疫亲和层析共同纯化出来，再把分离下来。通过SDS分离后，再用串联的质谱分析鉴定。利用这种方式我们证实了大量的与M-Ras组成激活形式共同被纯化下的蛋白质。在这些蛋白中，我们证实了RasGAP相关蛋白IQGAP1，它是与M-Ras相互作用的一个新的蛋白质。这种方法适合多种蛋白，对研究蛋白质相互作用十分有益。 简介 蛋白质互作几乎是细胞内每个功能水平都出现的，包括亚细胞结构，各种细胞膜的机械转运，染色体包装，基因表达调控，细胞内信号传导。蛋白质互作异常将导致很多种疾病，所以对蛋白质互作的研究成为生命科学领域极为紧迫的一件事。蛋白质复合体的纯化可以应用多种方法，包括经典的分子筛和凝胶过滤，以及这个不同的亲和色谱法分离。免疫亲和的方法是目前最具说服力的纯化方法，通常用于证明体内蛋白质互作和复合体中相互作用的物。一个经典的免疫亲和实验中，细胞裂解液中的蛋白复合体能被固定化了的抗体获取，该抗体识别复合体中已知成分的抗原决定簇。经过多次洗涤以去除非特异性结合蛋白，该复合体由质谱法分析。 这种方法的缺点是，对感兴趣的蛋白质需要一种特异的抗体（Ab），许多时候这种亲和导致纯化效率很低。Ab除了和靶蛋白外的其他蛋白交联是另一个缺点。这时，与靶蛋白不相关的蛋白或蛋白复合体被纯化下了，导致假阳性。通过抗原决定簇标签把抗原结合到特异的抗体上，形成普通的抗体。为此，需要一个带有抗原决定簇标签的抗体和一个高亲和力的抗原。通用的标签有Myc，Flag，相应抗体已经被商品化。操作说明被标准，不要求每一部都在最适合的条件。虽然抗原决定簇标签适用于大范围的纯化实验，但是其局限于稳定的复合体。结合较弱的或者瞬间结合的复合物会被忽视，进而不能被分析出来。短暂性结合复合体，其解离常数高，在洗脱非特异结合条带时被洗脱下来。这些步骤不要严谨操作，在高盐或洗涤剂浓度时效率高。在温和条件下，重复洗涤也将洗脱掉结合不紧密的成分。 通过化学交联可以阻止蛋白质复合体特异组分的丢失。有效地化学交联剂是甲醛。甲醛的几个特点应用于蛋白质互作的研究。1，交联发生在近距离（2A），被交联的蛋白位置很近。2，甲醛可以扩散到细胞膜且是非特异的，有益于广谱的蛋白互作研究。3，甲醛几乎在添加到细胞内后阻止酶反应，可以提供添加时瞬间的互作情形。4，一旦交联反应完成，反应物可用于非生理条件下操作，并保持结构完整性。另外，交联是可逆的，可以随后分析复合体组分。 甲醛温和处理和免疫沉淀在分析转录因子，与染色体结合的多聚配合物，核小体位置的确定，核小体动力学和核小体再构建方面。最近，甲醛交联与免疫沉淀和Western杂交结合，成功分析了，在酵母里是否TATA结合蛋白，TF IIB，SAGA组氨酸乙酰转移酶是否直接与转录结合蛋白结合。最近，作者在哺乳动物细胞中，采用了新的分析蛋白质互作方法，即甲醛交联结合免疫亲和层析，基于质谱分析的蛋白鉴定。利用这种方式我们证实了大量的与M-Ras组成激活形式共同被纯化下的蛋白质。共免疫沉淀和Western杂交证实很多蛋白互作。在这些蛋白质，我们证实了RasGAP相关蛋白IQGAP1，它是与M-Ras相互作用的一个新的蛋白质。进一步研究去解释其互作的生物学功能。 2材料与方法 2.1 抗体与试剂 抗Myc的小鼠抗体mAB（clone 9E10）来自于H. Ziltener博士。抗IQGAP1和抗Rac的小鼠抗体是购买于BD生物科学公司。抗Rap1的兔多克隆抗体购买于Santa Cruz生物技术公司。羊抗鼠和羊抗兔的二抗来自DAKO公司。羊抗鼠Alexa Fluor 680二抗来自分子探针公司。另外的试剂来自Fisher Scientific。 2.2 细胞系和细胞培养 R6X细胞（依赖于白介素3双点位的鼠肥大细胞/巨噬细胞系）感染双顺反子逆转录病毒载体基于pMXpie，其稳定表达绿色荧光蛋白和天然的M-Ras和突变的组成型激活M-Ras，它们都带有氨基端的Myc标签。R6X细胞在37℃,5%CO2，RPMI1640培养基中加2mm的l谷氨酸盐，100单位/ml的青霉素，50ug/ml的链霉素，10%胎牛血清，2%的10倍的培养基，在WEHI-3B没有的作为白介素3的