蛋白质组学方法的研究葡萄糖对人血清白蛋白的修饰作用.pdfVIP

全国生物医药色谱学术交流会(2008)论文集 C25蛋白质组学方法研究葡萄糖对人血清白蛋白 的修饰作用 李淳彭博庆宏李玉娟才德 肖盛元邓玉林书 北京理工大学生命学院 100081 1前言 End 晚期糖基化终产物(Advancde Products，AGEs)先由还原糖(葡萄糖)的羰 Glycation 基(醛基或酮基)与生物分子(如蛋白质或脂质)的游离氨基反应形成早期可逆产物schiff碱， 再经分子内重排形成更稳定的Amadori产物，进一步脱水和凝聚形成不可逆的终末产物。AGES 与很多疾病相关，如糖尿病及其并发症，肾衰竭‘11以及老龄化‘2～1。 本文主要是研究人血清白蛋白(HumanSerumAlbumin)与不同浓度的葡萄糖发生糖基化 反应，属于体外糖基化HSA。本文利用ESI．TRAPMS与LC联用技术，通过差异蛋白质组学 方法，寻找差异肽段，研究糖基化HSA的修饰位点以及发生修饰种类，对于进一步寻找临床 。 诊断糖尿病以及老龄化的肽类生物标志物具有重要意义。 2方法 ‘ 人血清白蛋白(HSA)分别与0．07M，O．5M，1．5M的葡萄糖在37。C恒温水浴中孵育O，10， 20，30天。将反应后的样品透析除盐，真空冷冻干燥、酶解、HPLC分离、质谱分析。 C18反相色谱柱，4．6x250mm 0,v．R．Grace＆Co．， ‘色谱条件：Vydac i．d．，粒径59in，孔径300h USA)。 流动相：A相是0．1％甲酸水溶液，流动相B是0．1％甲酸乙腈溶液。对于A相来说梯度洗脱 60出。 1 100LC／MSD Mass 1000m／z， 质潜条件：ESI／MS(Agilent Trap)，正离子模式，‘参数是：Target Nebulizer30．0 flow8．0 3200 3．5 pressurepsi，Drygas 1／rnin．，DrytemperatureC，capillaryvolmge skimmer40V ‘ kV,and volmge 3结果与讨论 HSA与1．5M的葡萄糖发生糖基化反应，随着时间的增加，有22个肽段浓度在逐渐下降。 当葡萄糖浓度降低到0．5M时，只有11个肽段随时问发生变化，这正符合了葡萄糖浓度影响 糖基化反应的理论，糖基化反应具有浓度依赖性，随葡萄糖浓度升高，糖基化反应也加剧。 HSA与0．07M葡萄糖发生反应的结果，检测到lO个浓度发生变化的肽段。实验结果表明， 即使葡萄糖在0．07M这样低的浓度下，仍旧有肽段发生糖基化，这10个肽段表现出很强的反 ’通讯作者：邓玉林，010E-mail：deng@bit．edu．cn 本文受国家自然科学基金20275005)资助。 ● 137 应活性，容易被葡萄糖修饰。将实验结果综合，发现有12个肽段既具有浓度依赖性又有时间 依赖性。将12个肽段的分子量分别力Ⅱ上不同产物增加的质量数，通过提取离子流来寻找相应 的糖基化产物，并鉴定到相应的糖基化位点，结果见表l。 4结论 上述实验表明HSA与葡萄糖发生糖基化反应是具有浓度依赖性和时间依赖性。随葡萄糖 浓度的增加，HSA发生糖基化的肽段增多，同时也随着时间的增加，糖基化反应加剧。但基